液晶生物傳感及其在微流控細胞分析中的應用

李瑋瑋，李雨軒，林金明

(清華大學 化學系，微量分析測試方法和儀器研制北京市重點實驗室 生命有機磷化學和化學生物學教育部重點實驗室,北京 100084)

液晶(Liquid crystal,LC)是一種性質介于固態和液態的物質態，既具備晶體固體的各向異性，也具備液體的流動性[1]。一種固體材料在完全轉變為各向同性的液相之前，可能經過一個或多個以分子取向為特征的中間液晶相，相轉變過程或受溶劑的影響，或受熱過程的驅動，相應的材料則被稱為溶致液晶和熱致液晶[2-3]。溶致液晶是當兩親分子在有機或無機溶劑中的濃度達到一定范圍時，通過自組裝有序排列形成[4]。熱致液晶由棒狀或盤狀的各向異性分子組成，相變過程受溫度變化影響，僅在一定的溫度范圍內呈現液晶性質[5]。在20世紀60年代到70年代間，液晶科學得到迅速發展，期間液晶顯示技術的發展在很大程度上也推動了基礎和應用研究[6]。液晶顯示器一般使用棒狀熱致液晶，LC分子在一定強度的外加電場作用下發生取向變化。也就是說，由各向異性分子組成的液晶與外加場相互作用，強烈地改變自身的排列結構。更令科學家感興趣的是，除了物理場之外，LC對界面化學和生物物質的變化也極為敏感。因此，近年來基于液晶化學/生物傳感器的研究取得了很大進展，拓寬了液晶材料的應用領域。液晶對界面的高靈敏響應和固有的光學各向異性(雙折射特性)是液晶傳感分析化學/生物物質的基礎[7]。生化分析物的刺激或界面附近發生生化反應會影響LC分子間相互作用的力平衡，導致LC分子排列取向改變。在偏光顯微鏡(POM)下，LC分子的這種取向改變呈現出不同的偏光形貌。因此，液晶傳感分析消除了對標記/標簽的需求，可通過LC分子有效地放大生化信號的光學響應。目前，已經有許多綜述介紹了液晶傳感器在生物化學分析領域的應用[8-10]。本綜述以近年來液晶生物傳感器在檢測生物小分子、生物大分子以及生物有機體(病毒、細菌、細胞)等方面的研究進展為線索展開介紹，特別提到了其與微流控細胞芯片結合的新興領域的發展和挑戰。

1 生物小分子分析

液晶生物傳感器已經被廣泛應用于生物小分子物質的檢測分析，比如寡肽、磷脂、尿素、葡萄糖等。Bai等[11]研究了二肽有序單分子膜上向列相液晶的取向有序性：向列相液晶5CB(4-氰基-4′-戊基聯苯)和TL205(含環己烷氟化聯苯和氟化三苯的介晶混合物)在二肽有序單分子膜上的排列取向明顯受二肽的手性和磷酸化狀態的影響。上述屬于一種液晶-固體界面型的液晶生物傳感器，然而由于水對生物分子的結構和功能具有重要的保護作用，因此一些關于液晶和水相形成界面的研究為創建液晶-水界面型的生物傳感器提供了新機會[12-13]。例如，Brake等[12,14]研究了引入磷脂的液晶-水界面上LC分子的排列取向變化，在純液晶-水界面上，LC分子傾向于平行于表面排列，即沿面排列(Planar)，而磷脂的引入誘導LC分子的取向變為垂面排列(Homeotropic)；在含有酶負載液晶層的生物傳感器上引入含脂質的水溶液可對酶促反應進行檢測，酶促反應發生前，LC分子由于磷脂的誘導作用在界面上呈垂面排列，隨著酶促反應進行，界面區域的脂質被耗盡，LC分子的取向變為平面排列，對應酶促反應進程，在POM下可觀察液晶層呈現不同的偏光光學形貌。類似的這種平面薄膜型的液晶傳感器(厚度通常為幾微米)，通過功能化修飾還可實現對抗生素及其水解酶的高靈敏檢測[15]。

液晶分散在水相溶液中形成的LC液滴也是液晶-水界面型傳感器的一種重要形式，在液晶生物傳感領域發展迅猛[16]。相比薄膜型液晶傳感器，LC液滴無需通過表面處理的固體基板來確定LC分子的初始排列方向，其分子的初始取向結構由液滴界面的化學性質決定[17]。目標分析物吸附到LC液滴表面或在LC液滴附近發生反應，觸發LC表面錨定的變化，從而使液滴內LC分子呈現不同的排列取向[18-19]。Park課題組[20-21]設計了一種聚(丙烯酸-b-4-氰基聯苯-4′-十一烷基丙烯酸酯)(PAA-b-LCP)功能化的5CB液滴，并將脲酶或葡萄糖氧化酶共價固定在PAA鏈上，在POM下實現了對尿素和葡萄糖分子的高靈敏檢測。除了將POM作為觀測手段，Duan等[22]將硬脂酸摻雜5CB微液滴作為傳感反應器和光學諧振腔，結合回音壁模式(Whispering gallery mode，WGM)激光技術，對生物小分子尿素進行了高靈敏檢測(圖1)：尿素和脲酶之間的酶促反應產生氫氧根離子，導致水/液晶界面的硬脂酸脫質子化和自組裝，誘導了LC分子的排列取向變化；WGM激光光譜的可探測位移與LC分子的排列取向相關，指示酶促反應進程并實現了對尿素的定量檢測。

圖1 硬脂酸摻雜的5CB微液滴作為傳感反應器和光學諧振腔，結合WGM激光技術用于尿素分子的檢測[22]Fig.1 Stearic acid-doped 5CB microdroplet as both optical resonator and sensing reactor,combined with whispering gallery mode(WGM) lasing technology for detection of urea[22]

2 生物大分子分析

液晶生物傳感器在檢測分析蛋白質、核酸等生物大分子方面也有廣泛的應用?；诒∧ば蚅C傳感器，Hu等[23]設計了一種適配體靶向誘導解離輔助的功能性LC傳感方法，可同時檢測血液中多種腫瘤標志物(見圖2)：適配體1(apt1)修飾的磁珠(MBs)特異性捕獲血液中的靶蛋白，靶蛋白包被的MBs與信號DNA/apt2共同孵育后，由于apt2對靶蛋白的特異性識別，在MBs上形成apt1/靶蛋白/apt2三明治復合物，誘導信號DNA釋放；信號DNA被負載互補DNA的LC傳感器特異性識別，引起LC傳感器偏光形貌的改變。類似地，他們還通過原位RCA反應放大腫瘤標志物信號，在原位RCA產物轉移到十八烷基三甲基溴化銨(OTAB)修飾的LC界面后，液晶層的偏光形貌由暗變亮[24]。微流控技術在制備液滴型LC傳感器方面展現出巨大優勢，制備的LC微液滴可用于生物大分子的特異性識別檢測。Khan等[25]通過液滴微流控的方法制備了PAA-b-LCP功能化的5CB液滴：與LCP嵌段緊密連接的PAA包覆在5CB液滴表面，通過共價偶聯對其進行生物素化修飾，用于特異性檢測水/LC界面上生物素(Biotin)—親和素(Avidin)的特異性反應：生物素和親和素在液滴表面特異性識別結合后，引起液滴表面電荷密度的改變，導致5CB液滴在POM下呈現從輻射(Radial，R)到雙極(Bipolar，B)的織構轉變，表明了功能化的LC液滴可通過配體-受體模型特定性地檢測蛋白質或其他分析物。

3 生物有機體分析

LC液晶傳感器在檢測細菌、病毒和細胞等有機體方面展現出了巨大的潛能。單分散的5CB液晶液滴可用于區分不同類型的細菌和病毒，接觸革蘭氏陰性(G-)細菌和脂膜病毒發生從B到R的織構轉變，而對G+細菌和非脂膜病毒則不會發生織構轉變[26]。上述織構轉變被歸因于脂質從生物體向LC液滴的轉移。LC傳感器在細胞層面的應用將有助于對細胞生命活動的探索，推動細胞生物學的發展。Yoon等[27]將與葉酸(FA)配體共軛的聚(苯乙烯-b-丙烯酸)嵌段共聚物(PS-b-PAA)修飾至5CB液晶液滴表面，LC液滴上的葉酸配體與人口腔表皮樣癌細胞(KB)的葉酸受體發生特異性相互作用，導致LC液滴發生R-B的織構轉變，實現了對KB細胞的特異性識別(圖3)。該研究小組[28]進一步設計了β-半乳糖與PS-b-PAA共軛修飾的5CB液晶液滴，對肝癌細胞(HepG2)的識別表現出了高度選擇性，HepG2細胞與β-半乳糖共軛的嵌段共聚物發生相互作用，有效地引起LC液滴發生R-B的織構轉變，他們認為嵌段共聚物的聚苯乙烯段將配體-受體的相互作用力從界面傳遞到LC液滴的內部。但是以上用于細胞識別的LC液滴的尺寸與細胞的尺寸相當，在檢測靈敏度上有待提高；另外，為了維持LC液滴在水相介質中的形貌，需加入表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)，但SDS對細胞的毒害作用可能影響細胞活性。為了獲得更加靈敏的響應和更好的生物相容性，Manna等[29]將液晶E7(一種向列相液晶混合物，向列相的溫度范圍TN=10～60 ℃)封裝在共價交聯的聚合物微膠囊中，實時檢測細胞周圍介質中是否存在對細胞有害的物質，但未追蹤細胞釋放的分子或離子的動態變化。

圖3 葉酸配體修飾的LC液滴體外檢測人口腔表皮樣癌細胞[27]Fig.3 Folate ligand anchored liquid crystal microdroplets emulsion for in vitro detection of KB cancer cells[27]

4 微流控芯片細胞分析中的應用

微流控芯片由于小型化、集成化等優點，容易實現與液晶傳感器的結合，在細胞分析領域具有廣闊的應用前景。將液晶生物傳感器引入微流控細胞芯片是細胞分析前沿的一個嶄新領域。本課題組在與微流控細胞芯片結合的液晶生物傳感方面進行了開發和研究：如通過設計一種具有良好生物相容性的聚合物封裝的液晶微滴(P-E7PBA)，可固定在微流控芯片上培養的細胞表面高靈敏度、高選擇性地實時監測細胞/單細胞釋放的NH3[30]：通過將摻雜4-戊基聯苯-4′-羧酸(PBA)的液晶E7封裝在聚電解質層層自組裝的微膠囊中制備P-E7PBA；由于P-E7PBA聚合物層外表面的氨基有利于其固定在負電荷的細胞膜表面，固定在細胞膜上的P-E7PBA響應細胞釋放的NH3，并引起自身表面電荷密度的改變，誘導了LC分子的排列取向變化，POM下可觀察到P-E7PBA從R到B的織構轉變?？紤]到P-E7PBA聚電解質層層自組裝的制備耗時，我們進一步設計了可直接固定在微流控芯片上培養的細胞表面的辣根過氧化物酶修飾的液晶彈性體微球(LCEM-HRP)，以超高分辨率、選擇性監測細胞釋放的H2O2(圖4)[31]：LCEM-HRP通過一種同心(Concentric，C)向輻射(Radial，R)的織構轉變(C-R)可視化實時報告細胞產生的H2O2，這是由于HRP催化還原H2O2引起了微球的去質子化和內部鏈間/鏈內氫鍵斷裂；細胞表面的LCEM-HRP發生C-R織構轉變的水平反映了細胞H2O2釋放量的差異，由此可探索細胞系和細胞-細胞的異質性。

圖4 一種辣根過氧化物酶修飾的液晶彈性體微球(LCEM-HRP)可直接固定在2D微流控芯片上培養的細胞表面監測細胞釋放的H2O2[31]Fig.4 Elastomer microspheres functionalized with horse-radish peroxidase(LCEM-HRP) can be immobilized directly on the surface of cells cultured on a 2D microfluidic chip to minitor the releasing of H2O2 from cells[31](A) LCEM-HRP immobilized directly on cell membrane to visualize the real-time releasing of H2O2 from a single-living cell;(B) LCEM-HRP responds to the releasing of H2O2 from cells,and changes the orientation of LC molecules;(C) With a POM,LCEM-HRP shows a concentric to radial transfiguration((A) LCEM-HRP直接固定在細胞膜上用于監測單個細胞釋放H2O2；(B) LCEM-HRP響應細胞釋放的H2O2，液晶分子的取向發生改變；(C) 在POM下，LCEM-HRP呈現從同心到輻射的織構改變圖像)

上述P-E7PBA和LCEM-HRP引入的均為2D微流控細胞芯片，隨芯片內微流體的層流流動，可直接固定在細胞表面對細胞釋放的分子進行特異性的實時監測，依托于微流控芯片的優勢，該方法顯著減少了樣品試劑的用量和體積。微流控細胞芯片除了支持細胞培養，還可為體外細胞模擬/重構體內細胞微環境[32-33]。在模擬細胞微環境下，如機械應力刺激、生化因子濃度梯度分布以及細胞-細胞相互作用等，通過集成的液晶生物傳感器實現對細胞及其微環境變化的監測，對細胞分析和細胞生物學的發展具有重大意義。

然而，目前將液晶生物傳感器引入微流控細胞分析還是一個嶄新的領域，面臨著許多問題與挑戰。首先，微流控芯片允許進行2D/3D細胞培養以及細胞微環境模擬，然而不同培養維度下細胞微環境在空間組織結構、物質傳輸方式、濃度梯度分布等方面存在差異性，要求設計適合不同細胞培養維度的液晶微傳感器以獲取真實的細胞生命活動信息。在2D靜態細胞培養條件下，檢測以細胞作為唯一來源或者消耗的物質濃度，與距離細胞的位置有直接關系，為了獲取接近細胞真實釋放或者消耗水平的定量檢測，有必要在細胞附近甚至是細胞表面引入一個位置明確的傳感器。能夠固定在細胞表面的液晶生物傳感器要求尺寸應在幾微米，且具有良好的生物相容性和長時間的機械穩定性，甚至可以在細胞表面以可控數量和明確位置進行精確固定，這需要進一步研究方可實現。而3D細胞培養具有更加復雜的化學性和空間性，對引入其中的液晶生物傳感器在滿足2D細胞培養條件的基礎上提出了更高要求。例如，向一種廣泛使用的3D細胞培養模型——多細胞微球中引入液晶生物傳感器以檢測細胞代謝物質，而對于引入傳感器的位置和幾何形狀設計，以及代謝物質向傳感器的運輸方式等問題尚需進行更深入的研究。此外，細胞界面現象的多樣性和復雜性，以及目標生化分析物呈現的化學官能團的多樣性和復雜性，不但增加了傳感設計的難度，也使得預測LC分子在含目標分析物的界面上的排列取向成為一個亟待解決的特殊挑戰。

5 結 論

液晶傳感器具有的許多獨特優勢，如對界面物理化學性質響應敏感，容易通過化學修飾實現對目標分子的特異性識別，無需對目標生物分子進行標記，界面液晶分子的取向變化傳至液晶本體快速放大信號響應，以及可實現小型化和生物相容性設計等，使其在生物傳感分析方面展現出了非凡的應用價值。本文針對近年來液晶生物傳感器在檢測分析生物大/小分子和生物有機體等方面的研究進展做了簡要綜述。此外，還特別介紹了新興領域——液晶生物傳感器引入微流控芯片細胞分析當前的發展與面臨的挑戰?？傊?，目前液晶生物傳感器已發展到檢測分析細胞等生物有機體，然而就液晶傳感器的尺寸、穩定性、特異性、生物相容性、傳感設計原理以及對不同細胞培養模型的適用性等諸多問題還值得進行更加深入的設計與研究。