基于網絡藥理學探討藏紅花抗動脈粥樣硬化的作用機制

楊 靜，任 星，張菀桐，高 蕊

（1.北京中醫藥大學研究生院，北京100029；2.中國中醫科學院西苑醫院，北京100091）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種常見的重要血管疾病，通常從受累動脈內膜開始，先后出現多種病變，包括脂質和復合糖類的局部積聚、纖維組織增生、鈣質沉積形成斑塊和動脈中膜的退變［1］。目前心腦血管疾病對人類的生命健康已構成了嚴重的威脅［2，3］，AS 作為心腦血管疾患的重要危險因素，發病率逐年增高，且呈現一定的年輕化趨勢，嚴重危及人類健康。因此，有效防治AS 成為了預防心腦血管疾病發生的關鍵［4］。目前抗AS 的治療主要通過他汀類降脂藥物進行干預，但其長期用藥的安全性備受爭議。劉昌孝［5］在對他汀類藥物的安全性風險評價中發現該類藥物具有肝損害、增加癌癥風險以及造成骨骼肌損害等不良反應。中醫認為痰濁、瘀血、毒邪（熱毒）阻滯損傷脈絡，日久脈絡瘀阻，是AS 發生的病機［6］，中醫中藥治療AS 具有獨特優勢及特色，多通過化痰泄濁、活血化瘀、清熱解毒等進行治療［7］。

藏紅花，又名“西紅花”、“番紅花”，為鳶尾科植物番紅花的干燥柱頭，性味甘、微寒，歸心、肝經，功能活血化瘀，涼血解毒，解郁安神，適用于經閉癥瘕，產后瘀阻，溫毒發斑，憂郁痞悶，驚悸發狂［8］。目前已有較多研究報告了藏紅花對心腦血管疾病的治療，認為藏紅花酸可能是其作用的物質基礎［9］。有學者利用藏紅花酸干預AS 大鼠模型發現其可以下調大鼠主動脈LOX-1 的表達，對AS 具有一定的療效。Asdaq 等［11］給予血脂異常大鼠藏紅花提取液，與對照組進行比較，藏紅花可顯著調節大鼠脂代謝紊亂從而到達抗AS 效果。以上研究表明，藏紅花具有一定的抗AS 作用，但其具體作用成分和機制尚未完全明確。

網絡藥理學作為藥理學的分支學科，運用網絡方法分析藥物與疾病及其靶點間的“多成分、多靶點、多途徑”的協同作用關系，各中藥在不同方劑中的配伍及加減運用亦體現了其多成分、多靶點、多途徑的特性，兩者特點相一致［12］。因此，本研究基于網絡藥理學的方法分析藏紅花抗AS 的活性成分及其作用機制，以指導臨床用藥并為下一步的藥理研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 獲取藏紅花藥物候選靶點

登錄中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TC‐MSP Databases），搜索并獲取藏紅花的藥物化學成分，根據類藥性≥0.18 進一步篩選藏紅花的有效化合物。根據藥物已知成分，在TCMSP Databasess 及Genecards Databases 獲取成分作用靶點，將獲取的靶點進行去重處理，排除重復靶點。運用Uniprot 數據庫査詢靶點蛋白對應的基因簡稱，得到藏紅花調控的疾病靶點。構建候選藥物成分-候選靶點網絡圖（candidate compound-candidate target network，cCcT network）

1.2 獲取AS 靶點

登錄DisGeNET 數據庫獲取疾病藥物作用靶點，以atherosclerosis（動脈粥樣硬化）為關鍵詞，人類基因為背景，提取數據庫中信度較高（score>0.001）的相關基因靶點，進行去重、統一名稱等處理，獲取疾病相關基因。 將所獲取的基因導入Cyto‐scape3.7.2 軟件中構建分子網絡，并進行可視化加工和拓撲結構分析，得到疾病-靶點網絡（Disease-po‐tential target network，D-pT network）。

1.3 藏紅花成分-AS 靶點網絡構建

通過映射cC-cT network 于D-pT network，得到藏紅花藥物成分治療AS 的靶點，應用Cyto‐scape3.7.2 軟件構建藥物-候選成分-AS 的候選靶點網 絡（Herb-potential compound-potential target net‐work，H-pC-pT network）。

1.4 GO 生物進程及KEGG 通路分析

將cC-cT network 與D-pT network 的映射基因導入Cytoscape3.7.2 軟件的ClueGO 插件中進行GO生物進程及KEGG 通路富集分析。

2 結果

2.1 藏紅花藥物化學成分篩選

利用TCMSP 數據庫，以藏紅花、西紅花、番紅花為檢索詞，以類藥性≥0.18 為條件篩選得到20 個化合物，并參考相關文獻加入2 個藏紅花常用活性成分［13，14］，共 得 到22 個 藏 紅 花 的 有 效 活 性 成 分。見表1。

表1 藏紅花活性成分基本信息Tab 1 Basic information of active components in saffron

2.2 藏紅花藥物候選靶點篩選

將上述獲得的22 個藏紅花活性成分引入TC‐MSP 數據庫及Genecards 數據庫，獲得16 個活性成分對應113 個疾病靶點（其中有6 個活性成分的疾病靶點未被TCMSP 數據庫及Genecards 數據庫收錄）。將上述獲得的藏紅花作用靶點輸入到Uniprot數據庫中査詢靶點蛋白對應的基因簡稱，剔除非人源靶點后最終得到藏紅花調控的疾病靶點106 個。構建候選藥物成分-候選靶點網絡。見圖1。該網絡共包含123 個節點，271 條邊。其中16 個節點代表藏紅花活性成分，106 個節點代表活性成分作用的疾病靶點，255 條邊代表成分與靶點之間的作用關系。越靠近中心的靶點在網絡中度越高，說明藏紅花中有多種藥物成分作用于該靶點。

圖1 藏紅花成分-靶點網絡圖Fig 1 Target network of saffron composition

2.3 AS 候選靶點篩選

應用DisGeNET 數據庫，以atherosclerosis 為關鍵詞檢索，獲得數據庫中信度較高（score>0.001）的相關基因靶點共117 個。利用Cytoscape3.7.2 軟件進行可視化加工和拓撲結構分析，構建疾病-靶點網絡，該網絡包含118 個節點，2 151 條邊，越靠近內層說明該靶點與疾病的相關度越高。見圖2。

圖2 疾病-靶點網絡圖Fig 2 Disease-target network

2.4 藏紅花成分-AS 靶點網絡構建

將藏紅花藥物候選靶點網絡（cC-cT network）映射于AS 靶點網絡（D-pT network），結果提示，藏紅花作用于26 個疾病靶點。見表2。應用Cyto‐scape3.7.2 軟件構建藥物-候選成分-AS 的候選靶點網絡（H-pC-pT network）。該網絡包含39 個節點，101 條邊。其中11 個節點代表藏紅花活性成分，26個節點代表藏紅花作用于AS 的靶點（基因簡稱）。在網絡中，一個節點的度表示網絡中和節點相連路線的條數。在化合物方面，有3 個化合物的度值≥6，分別是藏紅花酸（crocetin），異鼠李素（isorhamne‐tin），槲皮素（quercetin）。提示在藏紅花治療AS 的過程中，藏紅花酸、異鼠李素、槲皮素3 種化學成分可能起主要作用。在化合物作用的疾病靶點方面，有4個靶點的相關度值較高，分別是內皮型一氧化氮合酶（NOS3），凝血酶（F2），過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG），前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）。說明在藏紅花治療AS 的過程中，作用的主要靶點是內皮型-氧化氮合酶，凝血酶，過氧化物酶體增殖物激活受體γ 及前列腺素G/H 合酶2。這體現了藏紅花多成分與多靶點之間共同作用的機制。見圖3。

表2 中藥藏紅花活性成分抗動脈粥樣硬化的靶點Tab 2 Targets of saffron active components against athero?sclerosis

圖3 藥物-候選成分-動脈粥樣硬化的候選靶點網絡Fig 3 Drug-candidate component-atherosclerosis candidate target network

2.5 藏紅花與AS 相互關系的GO 生物進程分析及KEGG 通路研究

將藏紅花作用于AS 的26 個基因靶點導入Cy‐toscape3.7.2 軟件的ClueGO 插件中進行GO 及KEGG 通路富集分析，得到藏紅花治療AS 相互關系的GO 生物進程及KEGG 通路結果。

2.5.1 生物進程聚類分析結果 通過GO 生物進程分析，獲得12 個藏紅花治療AS 生物進程。見圖4。圖中面積越大，表示聚類至此生物功能的映射靶點越多，可得知藏紅花治療AS 可能主要是通過參與影響以下體內生物進程：（1）活性氧代謝過程的正調控；（2）調節平滑肌細胞增殖；（3）活性氧生物合成過程；（4）膠質細胞增殖的正調控；（5）趨化因子的生物合成過程等。

圖4 藏紅花抗AS GO 生物進程聚類分析結果Fig 4 Cluster analysis results of saffron anti-AS and GO biological process

2.5.2 KEGG 聚類分析結果 為進一步探究藏紅花抗AS 的具體機制，開展KEGG 通路探索，共獲得23 個信號通路，將其中與AS 相關的通路作為研究候選通路，包括：（1）VEGF 信號通路；（2）糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路；（3）流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路；（4）NF-kappaB 信號通路。見圖5。

圖5 藏紅花抗AS KEGG 通路Fig 5 KEGG pathway of saffron in the treatment of atherosclerosis

2.5.3 基于網絡藥理學初步探索藏紅花抗AS 的作用機制 結合上文藏紅花與AS 相互關系的GO 生物進程及KEGG 通路結果?？傻弥丶t花抗AS 的相關通路包括VEGF 信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路和NF-kappaB 信號通路。通過查詢上述通路在KEGG 數據庫中的相關作用并結合既往文獻，初步建立藏紅花抗AS 的相關通路示意圖。見圖6。

圖6 藏紅花抗AS 相關通路示意圖Fig 6 Pathway of saffron in treatment of atherosclerosis

3 討論

本研究運用網絡藥理學方法，通過分析藏紅花與AS 分子網絡在生物功能方面的異同，初步探索藏紅花抗AS 的作用機制。GO 生物進程聚類分析和KEGG 通路聚類分析表明藏紅花抗AS 可能主要通過參與活性氧代謝過程的正調控、調節平滑肌細胞增殖、活性氧生物合成過程、膠質細胞增殖的正調控、趨化因子的生物合成過程等生物進程。在信號通路的調控方面，藏紅花抗AS 可能主要調控VEGF信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路和NF-kap‐paB 信號通路。晚期糖基化終產物（AGEs）是由蛋白質、脂質和核酸的非酶促糖基化和氧化產生的一組復雜的化合物［15］。RAGE 作為AGE 的模式識別受體，屬于免疫球蛋白超家族細胞表面分子的多配體受體，與積極參與炎癥和免疫反應的配體相結合［16］。

AGE/RAGE 信號傳導引起涉及NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPKs 的多個細胞內信號途徑的激活，從而導致NF-κB 活化［1-19］。NF-κB 能促進促炎性細胞因子（如IL-1、IL-6 和TNF-α）以及與AS 相關的 基 因 血 管 內 皮 生 長 因 子（VEGF）的 表 達［20］。VEGF 能特異性地促進血管內皮細胞有絲分裂的生長因子，刺激內皮細胞合成氧化氮并上調氧化氮合酶的表達，促進新生血管形成［21］。新生血管管壁不完整，通透性強，可為斑塊局部提供養分，進一步促進AS 的發展［22］。剪切應力代表了血流施加在血管壁內皮表面的摩擦力，它在血管生物學中起著核心作用，并有助于AS 的發展［23］。低剪切應力通常會上調內皮細胞（EC）基因和蛋白，從而促進動脈壁的氧化和炎癥狀態，導致AS［24］。反映這種ECs 紊亂狀態的重要轉錄事件包括激活蛋白1 和核因子kappaB 的激活［25］?；衔?疾病靶點網絡分析顯示，藏紅花治療AS 的主要有效成分為藏紅花酸、異鼠李素、山奈酚和槲皮素。有研究表明藏紅花酸是一種天然的類胡蘿卜素二羧酸，在體內和體外模型中都有促血管生成的作用，可以通過調節VEGF 信號通路促進血管內皮細胞血管生成［26］。藏紅花酸還能增加HO-1/NRF-2 的表達，降低核因子-κB（NF-κB）mRNA 和蛋白的表達，從而抑制AS 形成［27］。異鼠李素是從中草藥沙棘中提取的黃酮類化合物，具有抗氧化和抗炎的作用［28］。一項動物實驗表明，異鼠李素能夠抑制小鼠體內TNF-α、IL-6 的產生，發揮抗炎作用［29］。槲皮素是一種中草藥中提取的黃酮類化合物。已有研究證實了它的抗炎、抗癌、抗氧化和抗凋亡活性［30］。槲皮素通過ROS 調節的PI3K/AKT 信號通路抑制炎癥和凋亡，從而減輕高果糖喂養誘導的動脈粥樣硬化。槲皮素通過減少活性氧的產生、抑制細胞凋亡和炎癥反應，從而抑制高果糖所致的動脈粥樣硬化［30］。

由此，筆者推測，藏紅花抗AS 可能主要通過藏紅花酸、異鼠李素及槲皮素等有效化學成分發揮抗炎及抑制血管新生的作用。