不同來源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥調查與優勢基因型分析

許弘儀 ， 辛宇航 ， 劉 娜 ， 張青青 ， 王 娟 ， 李月華 ， 黃秀梅 ， 王龍光 ， 曲志娜 ， 劉煥奇

(1. 青島農業大學動物醫學院 ， 山東 青島 266109 ； 2. 中國動物衛生與流行病學中心 ， 山東 青島 266032)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一種常見的致病菌，廣泛存在于自然界，可以引起人和動物多種疾病。隨著藥物濫用和用藥不規范，耐藥菌株日益出現，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)的出現，不僅給養殖業帶來損失，在人類疾病的治療中也帶來了巨大的困難，其引起的膿毒血癥、菌血癥等全身感染疾病發病率居高不下，并且病死率超出非MRSA感染病例。近年來，多項研究表明，動物源MRSA，尤其是豬源MRSA檢出率逐漸增高，多篇報道證實，歐美地區的主要流行型別ST 398能夠引起人的臨床感染[1]，亞洲地區流行的ST 9也從養殖場工作人員分離得到，這說明同一基因型已經能夠通過養殖、屠宰和消費等環節向人類傳播。因此，本研究對來自10個省份3種動物源4 755份樣品進行分離鑒定，對篩選出的239株MRSA進行MLST分型試驗和藥敏試驗，分析不同來源MRSA的流行分布、耐藥特征與優勢基因型，探討基因型與耐藥表型的相關關系，為臨床合理用藥、有效控制MRSA的流行傳播提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 7.5%氯化鈉肉湯、金黃色葡萄球菌顯色培養基、胰蛋白胨大豆肉湯、細菌瓊脂粉，均購自北京陸橋技術股份有限公司；GoTaq Green MasterMix酶、DNA marker DL1 000，均購自TaKaRa公司；96孔藥敏板，購自上海星佰生物技術有限公司。生物安全柜、恒溫培養箱、分光光度計、比濁儀、PCR儀、電泳儀、XR凝膠成像分析儀、快速渦勻器等，均由本實驗室提供。

1.2 樣品來源與質控菌株 4 755份樣品，自2015年4月—2017年9月從湖北、江西、山東、河南等10個省份采集獲得，其中豬鼻腔拭子3 119份、牛鼻腔拭子895份、雞咽拭子741份；質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213，由中國動物衛生與流行病學中心致病微生物監測室提供。

1.3 方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌的分離 將樣品置入7.5%氯化鈉肉湯，37 ℃增菌8～18 h后，接種于金黃色葡萄球菌顯色培養基，37 ℃培養18～24 h，挑取疑似菌落再次接種顯色培養基，重復3～4次，同時以金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)為陽性對照。

1.3.2 金黃色葡萄球菌與MRSA的鑒定 采用煮沸法提取菌株DNA作為模板，根據參考文獻[2]設計16S rRNA、nuc和mecA引物序列，用PCR法進行擴增，反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸5 min。擴增產物用1.3%的瓊脂糖凝膠進行水平電泳，觀察結果，同時擴增出16S rRNA、nuc條帶的菌株為金黃色葡萄球菌，同時擴增出16S rRNA、nuc、mecA條帶的菌株為MRSA。

1.3.3 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法測定MRSA的藥物敏感性，記錄試驗菌株的最小抑菌濃度。根據96孔藥敏板說明書接種菌液后，將藥敏板放置于37 ℃恒溫箱中，孵育16～24 h后在質控菌株ATCC 29213的最低抑菌濃度滿足要求的前提下進行結果判讀。試驗菌的結果用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報告，對3類及3類以上抗菌藥物同時耐藥的菌株記為多重耐藥菌。

1.3.4 多位點序列分型(MLST) 選取7對管家基因arcC、aroE、glpF、gmK、pta、tpi、yqiL，按參考文獻[2]設計相應引物，進行PCR擴增，反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物送擎科生物公司進行雙向測序，測序結果與標準序列進行對比并剪切后，輸入PubMLST網站查詢每個等位基因的序號，由7個序號確定菌株的ST型。

1.3.5 數據處理與分析 將所有菌株的耐藥譜和分型信息等錄入BioNumerics 7.6軟件，構建最小生成樹和聚類分析，探討不同ST型別菌株間的親緣關系。

2 結果

2.1 不同來源及不同地區菌株分布情況 共采集4 755份樣品，分離獲得1 442株金黃色葡萄球菌，包括239株MRSA，見表1。其中豬源樣品共檢出1 081株 (34.66%)金黃色葡萄球菌，包括203株(18.78%)MRSA；牛源樣品共檢出187株(20.89%)金黃色葡萄球菌，包括27株(14.44%)MRSA，其中23株來自河北省，山東省未檢出牛源MRSA；雞源樣品共檢出174株(23.48%)金黃色葡萄球菌，包括9株(5.17%)MRSA，全部來自山東省。

表1 各省份金黃色葡萄球菌和MRSA檢出率Table 1 Isolation rate of S.aureus and MRSA in different province

2.2 耐藥結果與分析 各省MRSA菌株對17種藥物均有不同程度的耐藥(表2)，其中山東省豬源MRSA檢出數量過多，僅挑選11株進行藥敏試驗。

由表2可知，豬源MRSA除對磺胺異噁唑和復方新諾明較為敏感，對其余藥物耐藥率均在20%～82%，對氟喹諾酮類藥物耐藥最為嚴重。各省豬源MRSA耐藥率差異明顯，重慶、山東、廣西壯族自治區(以下簡稱廣西)、廣州、河北菌株耐藥情況嚴重，對青霉素、苯唑西林、頭孢菌素、克林霉素和喹諾酮類藥物的耐藥率普遍在80%以上，部分省份達到100%；湖北、河南、江西、黑龍江、陜西僅檢測出對恩諾沙星、氧氟沙星和利奈唑胺有較高的耐藥率，江西和河南僅檢測出對苯唑西林、頭孢噻呋和慶大霉素的耐藥率，分別分布在15%～55%不等。

河北省牛源MRSA對青霉素、紅霉素、克林霉素和頭孢類藥物耐藥率100%，未檢測到恩諾沙星和利奈唑胺等藥物的耐藥菌株；廣西菌株未檢測到磺胺異噁唑和利奈唑胺耐藥菌株。山東雞源MRSA耐藥情況嚴重，對多數藥物耐藥率為100%，僅對磺胺異噁唑、復方新諾明、氟苯尼考和利奈唑胺敏感。

2.3 多重耐藥情況 重慶、山東、廣西、黑龍江和廣州豬源MRSA全部為多重耐藥菌株，多數為8～10耐；湖北、河南、江西等地多重耐藥率在30%～80%不等，主要為1～4耐。牛源和雞源MRSA全部為多重耐藥菌株，分別集中在4～7耐和9～11耐。

2.4 MLST分型 來自10個省的179株MRSA共分為4個ST型(表3)，ST 9為優勢型別，在3種動物源中都有分布，其次是ST 59，分布在豬源和牛源，ST 398和ST 1376僅出現在豬源。

表3 不同來源MRSA分離菌株的MLST分型結果Table 3 MLST results of MRSA isolated from different sources (株)

由封二彩版圖1可知，143株豬源MRSA共分為4個序列型，其中ST 9為優勢型別，其次是ST 398、ST 1376和ST 59。ST 9在除陜西和河北之外的8個省中均有檢出，ST 398在重慶、河南和山東檢出，ST 1376在湖北和陜西檢出，ST 59在重慶和河北檢出；牛源MRSA分為2個序列型，ST 9和ST 59；雞源菌株全部為ST 9。

圖1 不同地區豬源MRSA遺傳最小生成樹Fig.1 Genetic minimum spanning tree of swine MRSA isolated from different sourcesC：重慶； D：山東； E：廣西； F：河北； G：廣州； H：江西； I：河南； J：湖北； K：黑龍江； L：陜西C:Chongqing; D:Shandong; E:Guangxi; F:Hebei; G:Guangzhou; H:Jiangxi; I:Henan; J:Hubei; K:Heilongjiang; L:Shaanxi

2.5 聚類分析 由圖2可知，ST 9和ST 1376的親緣關系在85%左右，ST 398和ST 9、ST 1376的親緣關系僅在15%，ST 59與其余3種型別無親緣關系。來自8個省份的123株豬源ST 9型菌株共產生46種耐藥譜，分別來自重慶和河北的ST 59型菌株，產生的耐藥譜相同。以上結果表明，ST型、分布地區和耐藥表型之間并沒有具體相關性。

圖2 不同來源MRSA聚類分析Fig.2 MRSA clustering analysis diagra

3 討論

本試驗分離的239株MRSA分別來自10個省份和3種動物源，其中豬源樣品來自10個省份的養殖場，具有廣泛的代表性。2018年李淑敏等[4]對河南等6個省份的480份豬鼻腔拭子進行鑒定，結果分離到104株金黃色葡萄球菌，其中36株為MRSA，檢出率為34.6%，高于本文的研究結果(18.78%)。目前，國內各省份豬源MRSA檢出率已報道的有黑龍江6.4%[5]、湖北12.1%[6]、河南33.2%[6]、四川33.67%[7]、上海54.22%[8]、陜西8.5%[9]、河北25%[9]，與本文結果相比存在差異的原因可能與樣品類型和地區有關，本試驗涉及的豬源樣品全部為鼻腔拭子，而其他研究者選擇的樣品類型還包括了畜舍環境、器具等，這使得分離率出現差異。

將山東、河北和廣西三地采集的動物源樣品進行對比發現，豬源樣品中MRSA分離率山東遠高于另外2個??；牛源樣品中雖然山東和廣西金黃色葡萄球菌檢出率較高，但MRSA檢出率遠低于河北(74.19%)，這可能是因為河北地區樣品采集較為集中，僅局限在幾個養殖場內，采集范圍不夠廣泛，并且采集的樣品為鼻腔拭子，并非牛奶樣品。

本試驗結果顯示，143株豬源MRSA對檢測的17種藥物都有不同程度的耐藥，除河北省外，其余地區全部對恩諾沙星耐藥，并且耐藥率多數在80%以上；重慶、山東、廣西、廣州和河北地區菌株對青霉素耐藥率高達100%，其余僅對利奈唑胺和磺胺類藥物敏感，與Cui等[9]和張強等[10]的研究結果一致。

牛源MRSA多重耐藥率達到100%，但耐藥情況與豬源相比較輕，對磺胺類藥物較為敏感，并且未檢測到利奈唑胺耐藥菌株；雞源菌株除了對磺胺異噁唑和利奈唑胺較為敏感外，對其余大部分藥物均有較高耐藥率，這是因為不同動物用藥不同，產生的耐藥譜也有所差異，但對臨床常用的青霉素類藥物普遍有較高的耐藥率。

據報道，歐美國家豬源MRSA主要流行株是ST 398[11-13]，亞洲地區是ST 9，本文豬源MRSA的MLST分型中，除陜西和河北外的地區優勢型別均為ST 9。2009年Wagenaar等[14]在四川等地區部分豬場圈舍塵土中分離到MRSA,優勢克隆為ST 9,也存在其變異體ST 1376；同年，Yan等[5]在黑龍江2個屠宰場豬鼻腔拭子中分離到MRSA，以ST 398為主，其次為ST 9，與本文試驗結果一致。本文27株牛源MRSA中，來自廣西的4株均為ST 9，河北的23株均為ST 59，與豬源結果相同。Kong等[15]2018年對醫院臨床分離MRSA進行MLST分型試驗發現，ST 59分離率達到28.9%，結合本試驗結果推測ST 59的基因型不僅存在區域性流行的特點，還能夠在不同動物之間進行傳播。在人醫方面，國內外研究結果顯示，多種ST型菌株均能感染人類，其中ST 239和ST 5占比較大[16-17]。從上述結果可以看出，一種的ST型能夠同時感染動物和人，但不同物種間的主要流行型別存在較大差異。

本試驗發現，MRSA的ST型與耐藥表型并無具體相關性，相同ST型菌株出現類似或相同耐藥譜僅發生在同一養殖場來源的菌株，由此推斷，決定耐藥譜的原因主要是養殖方式與用藥習慣。但比起國內分布廣泛的ST 9和其變體ST 1376、ST 59和ST 398的多重耐藥情況明顯較輕。

綜上所述，各地MRSA均有較高的檢出率，并且基因型已出現國內流行型ST 9的變體ST 1376。MRSA耐藥率和多重耐藥性均處于較高水平，無論是對于養殖業還是人醫臨床都是巨大的影響。MRSA能夠在不同物種之間傳播，大大增加了人通過食用動物源食品感染的風險，這又給MRSA的防控增加了難題。因此,在生產養殖過程中應合理規范使用抗生素,加強特殊耐藥表型菌株的監測，及時掌握其流行分布特征，為其有效防控提供依據。