1例結石患犬尿液中犬種布魯氏菌的分離與鑒定

黃 薇 ， 蔣 卉 ， 馮 宇 ， 肖 盟 ， 繳 瑩 ， 劉 洋 ， 季玲西 , 呂艷麗，4

(1.中國農業大學教學動物醫院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.中國獸醫藥品監察所 國家/OIE布魯氏菌病參考實驗室 ， 北京 大興 102600 ； 3.中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科 侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室 ， 北京 東城 100730 ； 4.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193)

犬布魯氏菌病(以下簡稱犬布病)是由布魯氏菌感染引起的人獸共患病。引起犬布病的細菌主要是犬種布魯氏菌(B.canis)，有時羊種(B.melitensis)、牛種(B.abortus)和豬種(B.suis)布魯氏菌也可導致犬布病。除了不孕癥、母犬流產、公犬睪丸炎和附睪炎等生殖系統疾病外，犬種布魯氏菌還可引起犬的無癥狀感染和淋巴結病、脾臟腫大及葡萄膜炎、椎間盤炎等多種臨床病癥。由于犬種布魯氏菌對人的致病力較牛種、羊種和豬種布魯氏菌弱，世界衛生組織(WHO)和世界動物衛生組織(OIE)都沒有將犬種布魯氏菌列入法定報告的人獸共患病病種，但國內外關于犬種布魯氏菌感染人的情況時有報道[1-3]，且人類實際感染數量可能遠遠高于確診病例的數量[4-5]。文獻報道犬可以通過尿液向外界排菌，但通過尿液向外界排菌所造成危害的嚴重程度鮮有人關注。本文通過對1例膀胱結石患犬尿液中的犬種布魯氏菌的分離鑒定過程進行描述，以期引起寵物診療人員和飼養、繁殖相關人員對犬種布魯氏菌病的高度重視，為防控人間犬種布魯氏菌病的發生提供科學依據。

1 患犬基本信息

博美犬，7歲，雄性，體重4.02 kg，因尿閉在外院導尿失敗而轉至中國農業大學教學動物醫院。在外院就診時經超聲引導穿刺排放尿液2次。體格檢查發現，患犬左側皮下隱睪，其他未見明顯異常。泌尿系統B超檢查結果提示，患犬膀胱內和前列腺段尿道結石。血常規檢查發現，白細胞總數升高至19.06×109/L(正常范圍：5.05×109～16.76×109/L)，葉狀中性粒細胞升高至14.29×109/L(正常范圍：2.95×109～11.64×109/L)，伴桿狀中性粒細胞增高至1.14×109/L(正常范圍：0～0.3×109/L)，提示急性炎癥。血清生化檢查未見明顯異常。尿液檢查發現，患犬尿液pH為7.5，輕度偏堿性。對患犬行膀胱切開手術取出結石并同時實施了去勢手術。對術中取出的結石采用布魯克結石紅外分析儀(布魯克北京科技有限公司)進行分析，結果顯示結石成分為95%鳥糞石和5%磷酸鈣。

2 細菌分離培養與鑒定

分別將術中采集的尿液和膀胱黏膜，術后第14天和第60天膀胱穿刺采集的尿液樣本及術后第60天采集的血液樣本進行了細菌分離培養與鑒定。

2.1 細菌分離培養 將術中采集的尿液和膀胱黏膜，分別接種到血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上于37 ℃條件下培養。接種后24 h，2種培養基上均未見細菌生長；繼續培養至48 h，可見接種尿液的血瓊脂培養基上有針尖大細菌菌落生長；繼續培養至72 h，可見血瓊脂平板上生長出直徑約0.5 mm、半透明、圓形隆起、表面濕潤、邊緣規則的菌落，數量為5×102CFU/mL。取單個菌落進行革蘭染色鏡檢，鏡下可見菌體呈革蘭染色陰性、短桿狀、球形或球桿狀細菌(中插彩版圖1)。膀胱黏膜37 ℃需氧培養72 h，未見細菌生長。

圖1 犬種布魯氏菌鏡下形態 (革蘭染色，1 000×)

2.2 細菌飛行質譜鑒定和16S rDNA PCR擴增與序列分析 將分離獲得的菌株經基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS，飛行質譜)技術分析，與綿羊附睪種布魯氏菌(Brucellaovis)最為相似，分值為9.159。將分離菌株進行16S rDNA PCR擴增和序列分析，布魯氏菌核苷酸序列同源性最高為99.7%。

2.3 布魯氏菌Bruce-Ladder PCR鑒定 參照GB/T 18648-2018 《動物布魯氏菌病診斷技術》[6]合成8對PCR序列引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，對分離菌株進行Bruce-Ladder PCR分子鑒定，反應體系：10× PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs (2.0 mmol/L)5.0 μL，Mg2+(50 mmol/L) 1.5 μL，8對 引物混合液(12.5 μmol /L)7.6 μL，TaqDNA聚合酶 0.3 μL，DNA模板(0.1 μg/μL)1 μL，超純水7.1 μL，共25 μL。擴增參數：95 ℃預變性7 min；95 ℃變性35 s，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，共計25個循環；最后72 ℃延伸6 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像分析，結果顯示，分離菌株為犬種布魯氏菌(圖2)。

圖2 分離菌株的Bruce-Ladder PCR擴增M：DL-5 000 DNA marker； 1：患犬分離菌株； -：陰性對照； +：犬種布魯氏菌標準株RM6/6

2.4 分別于術后第14天和第60天再次穿刺采集尿液進行細菌分離鑒定及菌落計數，分離獲得的細菌仍為犬種布魯氏菌，菌落計數分別為4×103CFU/mL和1×105CFU/mL。術后第60天同時采集了患犬抗凝血進行細菌培養，37 ℃培養72 h，未見細菌生長。

2.5 布魯氏菌血清學檢測 初次分離的細菌經MALDI-TOF-MS技術分析初步鑒定為綿羊附睪種布魯氏菌后，采集患犬血清進行布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(抗原由中國獸醫藥品監察所國家動物布魯氏菌病參考實驗室制備)，結果顯示，犬種布魯氏菌凝集試驗陽性(+)，光滑型布魯氏菌凝集反應陰性(-)。采用膠體金凝集試紙條對血清樣本進行驗證，結果與虎紅平板凝集試驗一致，即犬種布魯氏菌陽性(+)(韓國安捷動物診斷試劑有限公司)，光滑型布魯氏菌陰性(-)(上?？祆`生物科技有限公司)。

3 討論

患犬因膀胱結石引起的尿閉前來就診，在常規導尿失敗后對患犬實施了膀胱切開取石手術，并針對患犬的隱睪問題，進行了公犬去勢術。手術同時，按照中國農業大學教學動物醫院常規流程對患犬尿液進行了細菌培養，分離菌株經系列鑒定后確定為犬種布魯氏菌。從結石患犬的尿液中分離出犬種布魯氏菌尚未見報道。本試驗同時發現，術后患犬尿液中的布魯氏菌含量呈上升趨勢，該生長趨勢有待于進一步探討，尿液排放至環境所導致的環境污染以及所造成的危害應引起高度重視。

3.1 犬種布魯氏菌的分離培養與鑒定 除了膀胱和尿道結石外，患犬術前未表現出睪丸炎、關節炎和椎間盤炎等犬種布魯氏菌感染的常見臨床癥狀。布魯氏菌為營養要求苛刻的需氧菌，通常48 h內罕見形成菌落，一般需要培養5～10 d甚至20～30 d[7]。本分離菌株的生長速度較快，故初次分離出的細菌在進行鑒定之前并未考慮其為布魯氏菌的可能性。隨后的MALDI-TOF-MS技術分析結果提示，分離菌株與綿羊附睪種布魯氏菌最為相似，獲得該鑒定結果的原因為綿羊附睪布魯氏菌與犬種布魯氏菌同為粗糙型布魯氏菌，有相似的脂多糖(LPS)結構，但該數據庫中未包含犬種布魯氏菌數據，因此該結果一方面為后續鑒定指明了方向，同時豐富了質譜數據庫資料。同樣，16S rDNA序列分析結果也未將犬種布魯氏菌與其他種布魯氏菌鑒別開來，因為16S rDNA 在布魯氏菌的不同種間差異很小[8]?；诓剪斒暇娜双F共患危害性，在獲得質譜鑒定結果后，采集了患犬血清進行了血清學試驗，分離菌株經中國獸醫藥品監察所國家布魯氏菌參考實驗室進行的Bruce-Ladder PCR鑒別診斷，最終確定為犬種布魯氏菌。

3.2 膀胱結石與犬種布魯氏菌的相關性 鳥糞石又叫磷酸銨鎂結石，幾乎95%的犬鳥糞石都是由脲酶陽性細菌感染引起的。產脲酶的細菌可將尿中的尿素水解成氨和二氧化碳，提高了尿液的pH，使銨離子可以形成磷酸銨鎂晶體[9]。犬種布魯氏菌是產脲酶細菌之一，該患犬尿液pH 7.5，并且穿刺獲得的尿液中僅培養出了犬種布魯氏菌。由此推測患犬膀胱中的鳥糞石形成與犬種布魯氏菌感染密切相關。

3.3 犬種布魯氏菌與公共衛生安全 在布魯氏菌感染病例中，通常具有流產、睪丸炎、附睪炎癥狀的病犬容易引起人們的關注和高度重視，但無癥狀或癥狀不典型的帶菌犬容易被人忽視。本病例先后3次從膀胱穿刺采集的尿液中分離出了犬種布魯氏菌，且菌落計數數量呈遞增趨勢。這對于試圖通過對患犬實施絕育和去勢手術以降低犬種布魯氏菌傳播風險[7]的愿景是一種挑戰。該分離結果源于布魯氏菌間歇排毒所致還是疾病發展不同階段所致，有待進一步研究。值得注意的是，排尿引起了犬種布魯氏菌對環境的污染，這種危害的嚴重性將遠遠大于犬種布魯氏菌感染生殖系統所致的風險，具有重要公共衛生意義，應引起寵物醫生、犬舍、流浪犬收容所和寵物主人，尤其是公共衛生主管部門的高度重視。盡管犬種布魯氏菌對人的致病力較弱，但作為一種人獸共患病，已有引起人類的敗血癥、心內膜炎[7]等疾病的報道。