孤雌產雌生殖品系松毛蟲赤眼蜂產卵強度對Wolbachia誘導的其生殖表型的影響

霍梁霄, 李媛媛, 張 丹, 于 茜, 寧素芳,趙 旭, 周金成,*, 董 輝,*

(1.沈陽農業大學植物保護學院, 沈陽 110866; 2.遼寧省農業發展服務中心, 沈陽 110034)

沃爾巴克氏體Wolbachia是一類廣泛存在于節肢動物中并能夠隨母系遺傳的胞內共生菌(Werrenetal., 2008; Gerthetal., 2014)，可調控宿主的生殖表型，如細胞質不親和(cytoplasmic incompatibility, CI)、雌性化(feminization)、殺雄(male-killing, MK)、孤雌產雌生殖(parthenogenesis, PI)等(Werrenetal., 2008)。此外，Wolbachia還參與到宿主卵子的形成過程(Kremeretal., 2009)，增強宿主的免疫反應(Chrosteketal., 2013)，阻斷病原物感染宿主，以及為宿主提供營養物質(Moriyamaetal., 2015)。開展Wolbachia對宿主生殖及其他表型的調控研究和揭示共生菌與宿主間的互作關系具有重要意義，相關理論和方法對控制害蟲種群和各類蟲媒傳播疾病也具有重要的應用價值(Hoffmannetal., 2015; 張艷凱等, 2015; Lopezmadrigal and Duarte, 2019)。

Wolbachia誘導宿主的生殖表型受Wolbachia滴度影響(Zchorifeinetal., 2000; Stouthamer and Mak, 2002; Uncklessetal., 2009; Osbomeetal., 2012; Bai?oetal., 2019)。例如，在寄生蜂中，當卵內的Wolbachia滴度足夠高時才發生孤雌產雌生殖的兩步機制(未受精卵先二倍化后雌性化的過程)(Maetal., 2015)。然而，宿主生殖表型與Wolbachia滴度之間的分子機制目前還不明確。

據報道，Wolbachia誘導多種膜翅目蜂類發生孤雌產雌生殖(張海燕, 2009; Ma and Schwander, 2017)。研究發現，前人通過抗生素或高溫去除或降低孤雌產雌生殖宿主體內的Wolbachia滴度，導致子代雄性個體或間性個體增多(Stouthamer and Mak, 2002; De Almeidaetal., 2010; Ningetal., 2019; 霍梁霄等, 2020)。這類研究發現Wolbachia滴度隨溫度(25～31℃)的升高或抗生素濃度的增加而降低(童蕾蕾等, 2012; 陳茜等, 2016; 寧素芳, 2017; Wangetal., 2017; Zhouetal., 2019)。這表明Wolbachia感染存在一個“閾值”對于調控宿主的生殖表型具有重要作用(Hurstetal., 2000; Bordenstein and Bordenstein, 2011)，且Wolbachia滴度與誘導宿主的表型呈現正相關關系(Breeuwer and Werren, 1993; Bourtzisetal., 1996; Ikedaetal., 2003)。本研究前期發現，無高溫和抗生素處理條件下，感染Wolbachia且營孤雌產雌生殖的松毛蟲赤眼蜂Trichogrammadendrolimi后代也會出現雄蜂個體。我們推測雌蜂高頻率的產卵將影響Wolbachia向子代的垂直傳播效率及滴度。開展該方面的研究不僅對Wolbachia與宿主之間的相互作用具有理論意義，也對應用孤雌產雌品系赤眼蜂，保障其生殖表型穩定性及生防潛力具有實踐意義。

松毛蟲赤眼蜂是一種寄生多種鱗翅目昆蟲的卵期寄生性天敵，對松毛蟲Deudrolimuspunctatus、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis和二化螟Chilosuppressalis等多種農林業重要的害蟲具有良好的生物防治效果(Wangetal., 2014; Lietal., 2016; 姜雪冰等, 2020)。與兩性生殖赤眼蜂相比，由于子代幾乎全為雌性，孤雌產雌生殖的赤眼蜂具有增殖能力強、易于定殖、生產成本低等優勢，因而具有較高的控害潛能(Stouthamer, 1993; Dongetal., 2017)。先前研究表明限制寄主卵量或控制雌蜂寄生時間導致子代雄性比降低(Hohmannetal., 2001; Lindsey and Stouthamer, 2017)。本研究以孤雌產雌生殖的松毛蟲赤眼蜂為研究對象，明確雌蜂產卵強度對Wolbachia滴度及子代性比的影響。研究結果將為孤雌產雌松毛蟲赤眼蜂的工廠化繁育提供理論依據，并為揭示宿主不同產卵強度下Wolbachia-宿主赤眼蜂的相互作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試松毛蟲赤眼蜂來自于沈陽農業大學害蟲生防實驗室繁育的松毛蟲赤眼蜂孤雌產雌品系。供試松毛蟲赤眼蜂均以米蛾Corcyracephalonica卵為寄主，保種繁育30代以上，遺傳性狀穩定。繁育環境條件：溫度25±1℃，相對濕度70%±5%，光周期16L∶8D。

寄主米蛾在養蟲室內用麥麩繁育多代，繁育環境條件：25±1℃, 相對濕度70%±5%, 光周期16L∶8D。試驗前取新鮮的米蛾卵(<24 h)粘在涂有阿拉伯樹膠的白色紙卡上，制成米蛾卵卡。米蛾卵卡用紫外燈照射處理40 min，殺死胚胎，供松毛蟲赤眼蜂寄生。

1.2 松毛蟲赤眼蜂的處理

為避免羽化后的赤眼蜂子代之間交配，預先將米蛾卵卡上的單個寄主黑卵粒(寄生4～5日后變黑的米蛾卵)切下后轉移至10 mm×45 mm指型管。隨機選取剛羽化(<12 h)的雌蜂作為供試蜂，每管1頭蜂。每頭雌蜂按下列分組分別進行處理:處理1：每日只有1 h提供新鮮充足的米蛾卵卡，供雌蜂寄生，持續7 d；處理2：隔日全天24 h提供新鮮充足的米蛾卵卡，供雌蜂寄生，持續7 d；處理3：每日持續提供新鮮充足的米蛾卵卡，供雌蜂連續寄生，持續7 d；對照組：每日只提供10%蜂蜜水不提供卵卡，持續7 d，該組雌蜂僅用于測定體內共生菌滴度。每處理和對照組45頭雌蜂，即重復45次。每天在同一時間段(9:00-10:00)對處理1的雌蜂提供充足新鮮米蛾卵卡。米蛾卵卡在處理條件下的雌蜂寄生完成之后，被分離到單個管中，避免再次被寄生。各處理和對照組的雌蜂每天均提供10%蜂蜜水。第8天，各處理雌蜂以液氮冷凍殺死后，以無水乙醇在-20℃下保存于1.5 mL離心管備用。統計母代雌蜂逐日產卵量(寄主米蛾卵變黑記為寄生)，一周內的累積產卵量。根據赤眼蜂的觸角形態和外生殖器鑒定雌性個體，雄性個體及雌雄間性個體(指個體組織擁有相同遺傳基因，但組織呈現出雄性和雌性的中間特征)(Ningetal., 2019)。待所有被寄生的米蛾卵內的子代蜂羽化后，在體視解剖顯微鏡(Motic, SMZ-161)下觀察并記錄子代性別及個數，統計逐日子代雄性比和一周內的累積子代雄性比。

1.3 雌蜂體內Wolbachia滴度分析

采用Chelex-100法對待測的松毛蟲赤眼蜂進行單頭總DNA的提取(Sumeretal., 2009; 柳曉利等, 2011)。以共生菌Wolbachia的wsp基因(GenBank登錄號: MG914000)拷貝數對雌蜂體內Wolbachia感染滴度進行定量分析。利用Primer Premier 5.0設計wsp基因特異性引物(上游引物: 5′-ATGAT GTAGCCCCAGAAATAC-3′; 下游引物: 5′-ACCAA AAGTGTTGTAAAGAA-3′)。以2 μL DNA樣品為初始模板,加入2×Es Taq Matermix(康維世紀, 北京)25 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O 21 μL共50 μL作為PCR擴增體系。PCR反應程序: 94℃預變性3 min; 然后以94℃ 變性30 s, 57℃退火3 min, 72℃延伸30 s為基礎，循環40次;最后以72℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，將預期目的條帶回收純化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序驗證。

采用SYBR Green熒光染料法，利用Bio-Rad CFX96TM實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad, 美國)進行絕對定量(absolute quantitative PCR, AQ-PCR)檢測。通過qPCR檢測梯度稀釋后目標序列引物CT值，計算標準曲線用于目標序列的絕對定量。以未產卵的雌蜂為對照，選擇了最具有代表性的不同產卵強度處理組(處理1和處理3)，每組設6個生物學重復，通過檢測wsp基因拷貝數確定雌蜂體內Wolbachia滴度，每重復測量3次，作為技術重復。

AQ-PCR的擴增體系(20 μL): 2×GoTaq qPCR Master Mix(Promega, 美國)10 μL,正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板(40 ng)1 μL,ddH2O 8 μL。qPCR擴增條件: 95℃預變性5 min; 5℃變性15 s, 55℃退火延伸45 s, 共40個循環。并在最后添加溶解曲線程序: 55℃ 5 s, 每5 s升溫0.5℃, 直至95℃。

1.4 數據分析

采用廣義混合效應模型(generalized linear mixed-effects model, GLMM)下的協方差分析，檢驗不同產卵強度處理下雌蜂日齡對逐日子代雄性比[二項分布(binomial distribution)]和母代雌蜂逐日產卵量[泊松分布(Poisson distribution)]的影響。采用GLMM下的卡方測驗分別檢驗產卵強度對累積子代雄性比(二項分布)、母代雌蜂累積產卵量(泊松分布)以及母代雌蜂體內Wolbachia滴度的影響。為了排除不同雌蜂個體及批次導致的系統誤差，在GLMM中，將不同雌蜂個體及批次設為隨機效應。采用Breusch-Pagan檢驗對模型的正態性和方差一致性假定進行檢驗，其中，對不符合假定的比例指標和整數指標，分別采用對數連接函數和logit連接函數轉換后進行分析。不同處理因素間的多重比較采用Tukey氏HSD法檢驗(α=0.05)。本試驗數據均采用R(3.6.2)軟件(R Developmental Core Team, 2019)分析。

2 結果

2.1 逐日子代雄性比和累積子代雄性比

雌蜂產卵強度(χ2=24.21,P<0.05)和日齡(χ2=110.30,P<0.05)均對松毛蟲赤眼蜂逐日子代雄性比存在顯著影響，但二者互作對逐日子代雄性比無顯著影響(χ2=2.01,P=0.37)。逐日子代雄性比隨赤眼蜂日齡的增加顯著升高(斜率±標準誤: 1.51±0.14,P<0.05)。持續供寄主卵的雌蜂(處理3)逐日子代雄性比顯著高于隔日24 h供寄主卵的雌蜂(處理2)(z=2.93,P<0.05)和每日僅1 h供寄主卵的雌蜂(處理1)(z=4.75,P<0.05)，而處理2逐日子代雄性比與處理1相比無顯著差異(z=-2.208,P=0.07)(圖1)。

圖1 產卵強度和日齡對松毛蟲赤眼蜂逐日子代雄性比的影響

雌蜂產卵強度對松毛蟲赤眼蜂累積子代雄性比存在顯著影響(χ2=10.11,P<0.05)。處理3累積子代雄性比顯著高于處理1(z=2.85,P<0.05)；處理2累積子代雄性比與處理3間相比無顯著差異(z=2.05,P=0.10)，與處理1之間也無顯著差異(z=-0.85,P=0.675)(圖2)。

圖2 產卵強度對松毛蟲赤眼蜂累積子代雄性比的影響

2.2 母代雌蜂逐日產卵量和累積產卵量

松毛蟲赤眼蜂母代雌蜂逐日產卵量受雌蜂產卵強度和日齡二者的交互作用顯著影響(χ2=202.43,P<0.05)。母代雌蜂逐日產卵量隨赤眼蜂日齡的增加均顯著降低(斜率±標準誤:-0.68±0.016,P<0.05)。處理3母代雌蜂逐日產卵量的下降幅度顯著高于處理2(z=7.22,P<0.05)和處理1(z=15.18,P<0.05)。處理2母代雌蜂逐日產卵量下降幅度顯著高于處理1(z=9.64,P<0.05)(圖3)。

圖3 產卵強度和日齡對松毛蟲赤眼蜂逐日產卵量的影響

雌蜂產卵強度對松毛蟲赤眼蜂母代雌蜂累積產卵量存在顯著影響(χ2=41.22,P<0.05)。處理3母代雌蜂累積產卵量顯著高于處理1(z=4.34,P<0.05)和處理2(z=6.22,P<0.05)，處理1母代雌蜂累積產卵量與處理2間無顯著差異(z=1.88,P=0.15)(圖4)。

圖4 產卵強度對松毛蟲赤眼蜂累積產卵量的影響

2.3 母代雌蜂體內Wolbachia滴度

根據子代雄性比結果，處理2與處理3和處理1相比均無顯著差異，且獲取處理2雌蜂樣本時間無法確定。因此，我們選擇了最具有代表性兩組處理，分別為處理3和處理1，并以未產卵的雌蜂為對照組，利用qPCR檢測雌蜂體內Wolbachia滴度變化。

雌蜂產卵強度對松毛蟲赤眼蜂母代雌蜂體內的Wolbachia滴度存在顯著影響(χ2=75.12,P<0.05)。未產卵雌蜂體內Wolbachia滴度顯著高于處理1(z=8.24,P<0.05)，而與處理3相比無顯著差異(z=1.34,P=0.37)(圖5)。

圖5 產卵強度對松毛蟲赤眼蜂體內Wolbachia滴度的影響

3 討論

研究結果發現，每日僅1 h供寄主卵處理能夠維持母代雌蜂體內Wolbachia滴度不變，使其維持孤雌產雌生殖表型。Lindsey和Stouthamer(2017)在研究短管赤眼蜂T.pretiosum時，也發現類似現象。有學者推測，宿主體細胞中的Wolbachia可持續轉移至卵細胞中，以維持卵細胞內較高水平的Wolbachia滴度(Ferreeetal., 2005; Serbusetal., 2008)。當母代雌蜂連續產卵時，卵細胞對體細胞內Wolbachia持續“提取”，最終導致赤眼蜂體內Wolbachia“枯竭”。因此當赤眼蜂體內Wolbachia滴度下降時，雌蜂在產卵后期會產出Wolbachia滴度較低的卵。一般而言，赤眼蜂的性別由其染色體倍性決定，即雙倍體受精卵發育為雌蜂，單倍體未受精卵發育為雄蜂(潘雪紅等, 2007; Ma and Schwander, 2017)。在赤眼蜂中，Wolbachia可誘導單倍體未受精卵第一次有絲分裂后期染色體分離失敗，導致染色體加倍形成二倍體胚胎，進而發育為雌性(Stouthamer and Kazmer, 1994)。當Wolbachia滴度降低時，其對宿主生殖表型的調控能力下降，使部分宿主恢復兩性生殖。另一方面，共生菌Wolbachia滴度受宿主細胞增殖的影響(張曉晨和馮紀年, 2018)。在持續供寄主卵處理中，Wolbachia的恢復速度可能落后于生殖干細胞的更新速度，導致母代雌蜂產下的卵內Wolbachia滴度不足以調控宿主未受精卵染色體加倍，使其依然維持單倍體，并最終發育為雄性。因此，通過控制雌蜂產卵的間隔時間，使卵細胞內保持較高水平的Wolbachia滴度，可使雌蜂有效維持孤雌產雌生殖表型。

本研究發現，松毛蟲赤眼蜂母代雌蜂逐日產卵量受產卵強度和日齡互作的影響。持續供寄主卵的母代雌蜂只有在第1日的日產卵量顯著高于每日僅1 h供寄主卵的母代雌蜂，而在隨后6 d，兩者的日產卵量無顯著差異。由于赤眼蜂卵巢內部分卵需通過雌蜂攝取外界補充營養來保障卵子發育成熟(黃靜等, 2015)。母代雌蜂在第1日產出大量的卵，而后期卵子尚未成熟，使雌蜂后期的日產卵量下降。研究結果還發現，持續供寄主卵的母代雌蜂累積產卵量高于隔日24 h供寄主卵的雌蜂(圖3)。該結果與前人研究(Stouthamer and Luck, 1993; Hohmannetal., 2001)不同。這可能是由不同的蜂卵接觸時間造成的，持續供寄主卵處理使母代雌蜂寄生時間充分，因而具有較高的累積產卵量?；诒狙芯拷Y果，在赤眼蜂規?；庇^程中應適當權衡產雌率與繁蜂效率間的矛盾，在保障繁蜂數量的同時，適當降低雌蜂產卵強度，將有助于提高子代雌性比，降低繁蜂成本，提高繁蜂效率。在孤雌產雌品系赤眼蜂規?；庇h節上，可考慮進一步開展相關研究，通過平衡繁蜂數量和雌性比兩者間的矛盾，改善規?；狈溥^程中的相關環節。

前人證明，孤雌產雌赤眼蜂種群與兩性生殖赤眼蜂種群在野外同時存在，且兩者間存在基因交流，即感染Wolbachia的雌蜂能夠與雄蜂交配育出雜交的可育子代蜂(Stouthamer and Kazmer, 1994)。在本研究中，感染Wolbachia的母代雌蜂產卵后期子代雄性比顯著升高(圖2)。雄蜂的出現將使孤雌產雌種群與兩性種群存在基因流動的可能。在田間，寄主卵資源通常具有波動性(Kunte, 1997; Royetal., 2001; van den Bosch, 2003)?；诒狙芯康慕Y果，我們提出猜想，即當寄主資源豐富時，雌蜂更容易找到寄主，產卵強度增加，導致孤雌產雌生殖的雌蜂在產卵后期產出少量雄性子代，可能將使孤雌產雌種群與兩性種群間基因交流的頻率上升，而寄主資源有限時，雌蜂可能花費更長時間尋找新的寄主，產卵間隔時間延長，產卵強度降低，將更有利于其維持孤雌產雌生殖表型。然而，關于田間孤雌產雌種群與兩性種群間的基因交流頻率及其潛在影響因素尚需田間調查數據的支撐。

本研究結果及前人研究均發現成蜂體內Wolbachia滴度對于維持其孤雌產雌生殖表型至關重要(Maetal., 2015; Lopezmadrigal and Duarte, 2019)。持續產卵將導致母代雌蜂體內Wolbachia滴度降低，使得Wolbachia調控染色體二倍化過程難以維持，導致孤雌產雌生殖表型部分喪失，最終育出一定數量的雄性子代。當規?；庇麓飘a雌生殖的松毛蟲赤眼蜂時，通過適當減少雌蜂產卵頻率和時間，可有助于維持雌蜂體內的Wolbachia滴度水平，提高雌蜂孤雌產雌生殖的穩定性，增加種群雌性比。另一方面，本研究通過室內測定產卵強度對雌蜂孤雌產雌表型的影響，將有助于揭示孤雌產雌生殖雌蜂產卵行為影響下的子代性別結構變化，為預測孤雌產雌赤眼蜂在田間的種群性別結構動態變化，揭示孤雌產雌種群和兩性生殖種群間的共存及互作關系提供依據，為評估和改善孤雌產雌品系赤眼蜂的室內繁育技術和田間持續控害能力提供參考。