貂源綠膿桿菌的分離鑒定及其生物學特性研究

許 皓，劉建榮，倪 佳，任 飛，王力欣，王 崢，劉 瑩

吉林特研生物技術有限責任公司,吉林長春 130122

綠膿桿菌是能夠引起急性、高度傳染性疾病的、可以導致水貂出血性肺炎的一種細菌。本菌革蘭氏染色呈陰性，單個、成雙或短鏈狀存在，能單向運動，無芽孢，能形成莢膜，能分泌綠膿菌素和熒光素。采用日本血清分型系統將綠膿桿菌分為A～N 14種血清型。近年來，我國山東省、河北省、黑龍江省、吉林省等地主要的水貂養殖地區持續暴發流行水貂出血性肺炎，對水貂的致病力往往是致死性的，造成水貂嚴重的出血性肺炎，給養殖戶帶來了巨大的經濟損失。本研究對2013～2016年不同省份病料的采集，進行了細菌分離鑒定和相關實驗，結果表明綠膿桿菌G、B、I是最流行的血清型，是導致養殖場水貂大規模死亡的原因。

1 材料

1.1 菌株

綠膿桿菌標準菌株ATCC27853為杭州天和微生物試劑有限責任公司的產品。

1.2 試驗動物

18～20日齡SPF級ICR小鼠，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司。

1.3 主要試劑

綠膿桿菌分型血清為日本生研株式會社的產品；瓊脂（Agar）均為Sigma-Aldrich公司的產品；蛋白胨、酵母粉均為英國OXOID公司的產品；NaCl為廣東光華科技股份有限公司的產品；PCR反應預混液Ex Taq? 為生工生物工程（上海）股份有限公司的產品；生化鑒定管、藥敏片為杭州濱河微生物試劑有限公司的產品。

1.4 主要儀器

超凈工作臺（SW.CJ.2FD）購自上海博迅實業有限公司醫療設備公司；空氣恒溫搖床（KYC111）購自上海?，攲嶒炘O備有限公司；PCR儀（T100TM Thermal Cycler）購自伯樂生命醫學產品有限公司；電熱恒溫水槽（DK-8D）購自上海精宏實驗設備有限公司；隔水式培養箱（BG-160）購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠；光學正置顯微鏡（Axio Lab. A1）購自卡爾蔡司公司。

2 方法

2.1 病料采集與細菌分離

423 份病料樣品來自2013～2016年山東省、河北省、黑龍江省、吉林省的82個水貂群，包括大、中、小型養殖場和各種類型的農村散養戶。發病水貂多表現為呼吸困難、鼻孔流血、突發性死亡等癥狀。采集患病水貂肺組織，用無菌剪刀在肺組織剪開一個切口，將接種環深入切口內取樣，劃線接種于PYG平板，37 ℃培養18～24 h后觀察，挑取各種優勢菌落傳代純化。

2.2 細菌培養

將采集的肺臟病料組織劃線接種于PYG平板上，37 ℃培養18～24 h后挑取疑似菌落進行傳代純化，再培養18～24 h后觀察菌落形態。同時，分別挑取3～5個單菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌體形態特征。

2.3 細菌PCR鑒定及分型

2.3.1 PCR引物

采用通用引物擴增16SrRNA基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。對疑似的綠膿桿菌菌株進行PCR鑒定。本實驗所用PCR引物詳見表1。

表1 本試驗所用PCR引物

2.3.2 模板的制備

用擴增的純化菌液，取1 mL加入1.5 mL離心管中，以10000 r/min離心10 min，棄上清液，加入100 μL ddH20混勻，煮沸15 min，12000r/min再離心15 min，取上清液即為模板。

2.3.3 PCR擴增

反應體系（40 μL）：PCR反應預混液Ex Taq?20 μL，無菌水18 μL，10 pmol/L上、下游引物各0.5 μL ，細菌基因組模板1 μL。PCR反應條件為：94 ℃變性5 min；30個循環，94 ℃變性40 s、56 ℃退火50 s、72 ℃延伸90 s，30個循環，72 ℃再延伸10 min，降溫至4 ℃保存。

PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠上120 V電泳分離25 min，核酸染料染色，凝膠成像系統照相后觀察分析。綠膿桿菌的PCR產物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，并對測序結果應用在線生物學軟件，進行NCBI數據庫搜索比對分析。

2.3.4 綠膿桿菌血清型分型

將綠膿桿菌菌種復蘇后分別用接種環劃線接種于PYG平板，置37 ℃培養18 h。各挑取單菌落再次分別劃線接種于PYG平板，置37 ℃培養18 h，各用5 mL生理鹽水將平板上的菌落洗下，制備成濃度均一的凝集原（菌數為8×109CFU/mL），2～8 ℃保存備用。準備潔凈的載玻片，用記號筆分區標記后，取20 μL制備的綠膿桿菌凝集原滴于載玻片上，再取待檢的水貂血清（簡稱待檢血清）20 μL置于凝集原上，同時取20 μL綠膿桿菌凝集原加20 μL生理鹽水作為陰性對照，取20 μL綠膿桿菌凝集原加20 μL綠膿桿菌抗水貂陽性血清（玻片凝集反應至少出現“+++”）作為陽性對照，用槍頭將凝集原和待檢血清混合，在30～60 s內用肉眼觀察結果。

2.4 綠膿桿菌的小鼠毒力試驗

對63株G、B、I型綠膿桿菌進行了小鼠半數致死劑量（50% Lethal Dose, LD50）的測定。

2.5 生化鑒定

按照文獻[3]采用細菌生化鑒定管對純培養物進行生化鑒定，接種后的發酵管置于隔水式培養箱中，培養18～24 h，統計生化試驗結果。

2.6 藥敏試驗

按照K-B紙片擴散法進行藥敏試驗及結果的判斷。

3 結果

3.1 細菌的形態與培養特性

綠膿桿菌在培養基上形成圓形、稍平、邊緣不整齊或者呈波浪狀、藍綠色的菌落，有獨特的芳香氣味；革蘭染色、鏡檢，分離菌株為革蘭陰性小桿菌，單個散在或成對出現（見圖1）。

圖1 綠膿桿菌菌落形態及鏡下形態

3.2 PCR鑒定結果

對分離菌株16 SrRNA 基因進行擴增，均擴增出大小為1421、1418 bp的DNA條帶（見圖2）。將分離菌株所測16SrRNA基因序列與GenBank中已收錄核酸數據庫進行同源性檢索，經比對后確定菌株為綠膿桿菌，分別與登錄號HQ641264.1、KF977858.1的綠膿桿菌16SrRNA序列同源性均為99%。

圖2 綠膿桿菌的PCR控增結果

3.3 綠膿桿菌血清型分型

按綠膿桿菌血清型分型方法對分離菌株進行鑒定，各血清型菌株均能與對應的標準陽性血清發生特異性反應（見圖3）。

圖3 綠膿桿菌分型結果

3.4 G、B、I型綠膿桿菌的小鼠毒力試驗結果

根據對63株綠膿桿菌的小鼠毒力試驗結果，篩選出小鼠毒力試驗中表現毒力最強的12株綠膿桿菌（4株G型、4株B型、4株I型）（見表2），標記為1～12號菌株。

表2 12株綠膿桿菌的小鼠毒力試驗結果

3.5 生化鑒定

生化試驗結果（見表3）表明，綠膿桿菌3種血清型12個菌株的十六烷三甲基溴化銨培養基上生長、明膠液化、硝酸鹽還原產氣試驗、42 ℃生長試驗結果均為陽性；綠膿菌素、氧化酶、乙酰胺培養基生長試驗結果存在差異，同一血清型的不同菌株之間也存在明顯差異。

表3 12株綠膿桿菌的生化鑒定結果

表4 12株綠膿桿菌的藥敏試驗結果

4 討論

綠膿桿菌是引起水貂出血性肺炎的重要病原之一，水貂感染該菌后，以出血性肺炎和敗血癥為主要特征，發病急、死亡快，常呈地方性暴發，發病貂死亡率在10%～50%[4,5]。隨著我國養殖毛皮動物的發病率持續上升，給毛皮動物養殖業造成了很大的經濟損失。日本的Homma（1976）根據O抗原將綠膿桿菌分為A～N的14個血清型，生研公司根據該系統生產的標準陽性血清試劑盒被廣泛應用于綠膿桿菌的血清學分析。白雪[6]等人于2011年采用日本生研公司的血清學分型系統對從各地患有出血性肺炎的水貂中分離到的45株綠膿桿菌進行了血清型分析，結果表明42株為G型，2株為B型，1株為I型，G型占93%，為主要流行血清型；丹麥的Hammer等人于2003年對72株貂源綠膿桿菌進行了血清型分析，其中75%為G型、8%為B型、C型占17%。本研究結果表明：引起水貂出血性肺炎的綠膿桿菌分離株主要血清型是G、B型，I型次之，這與白雪、Hammer等人研究結果一致。

本研究通過小鼠毒力試驗篩選出12株毒力較強的菌株，進行了生化試驗及藥敏試驗。生化試驗結果表明：12株菌株的十六烷三甲基溴化銨培養基上生長、明膠液化、硝酸鹽還原產氣試驗、42 ℃生長試驗結果均為陽性；綠膿菌素、氧化酶、乙酰胺培養基生長試驗結果存在差異，同一血清型的不同菌株之間也存在明顯差異。藥敏試驗結果表明：12株菌株對強力霉素、林可霉素均耐藥；對阿米卡星為敏感；對慶大霉素、阿莫西林、氨芐西林、新霉素均為耐藥或介于中間；對環丙沙星、諾氟沙星、青霉素G、鏈霉素、多粘菌素B、四環素的敏感性不同；對氧氟沙星為敏感或介于中間，這可能與養殖場大量不合理地使用抗生素有關，有待進一步研究。

本研究對所分離到菌株的菌體形態、血清型、生化特性、藥物敏感性等生物學特性進行了系統鑒定，為進一步客觀評估水貂出血性肺炎的危害及其綜合防控提供參考依據。