基于現行黃芪多糖生物活性檢測方法的分析

馬發順，蔡暢，梁秀麗，宋玉偉，元雪湞

（1.安陽工學院生物與食品工程學院，安陽 455000；2.河南省獸用生物制品研發與應用國際聯合實驗室，安陽455000；3.河南省獸藥飼料監察所，鄭州 450000）

黃芪多糖（APS）是由豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根經提取、濃縮、純化而成的水溶性雜多糖[1]，具有增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗衰老、抗應激、護肝、抗病毒和較廣泛的抗菌作用[2-3]。關于黃芪多糖生物活性的報道主要有注射黃芪多糖觀察細胞超微結構的變化、黃芪多糖對免疫細胞的增殖作用和細胞因子分泌量的變化等[4-7]。而《中國獸藥典2015版（二部）》中規定的黃芪多糖生物活性檢測方法是以小白鼠為試驗動物，通過觀察脾指數的變化判斷黃芪多糖的生物活性，陳明志等[8]、丘成楨等[9]、黃志遠等[10]曾有過此方面報道，但沒有對現行黃芪多糖生物活性檢測方法的統計分析與評價。本研究基于我國獸藥典提供的黃芪多糖生物活性檢測方法，對檢測結果進行統計分析，從而對現行黃芪多糖生物活性檢測方法進行探討和評價，為黃芪多糖生物活性檢測方法的改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 試驗動物

昆明鼠（18～20 g，SPF級），購自河南省實驗動物中心。使用獨立送風隔離籠具飼養，設定溫度20℃～26℃，濕度40%～70%，供給足量飼料，自由采食和飲水。

1.1.2 儀器和藥品

電子天平（型號為ES3200），天津市德安特傳感技術有限公司生產；梅特勒分析天平（型號為AB204-N），上海雙旭電子有限公司生產；獨立送風隔離籠具（型號為IVC-Ⅱ），上?？禐獒t療科技發展有限公司生產。黃芪多糖注射液（規格以C6H12O6計10 mL：0.1 g），河南省各獸藥生產廠提供；生理鹽水（規格為250 mL），購自河南科倫藥業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

3種黃芪多糖樣品分別獨立試驗設計。每種樣品均設試驗組和對照組各8只小鼠，3次重復試驗；整個試驗共用小鼠144只。購買的試驗動物適應性喂養2 d后進入正試期，試驗組每只小鼠腹腔注射黃芪多糖注射液0.5 mL/d，對照組每只小鼠腹腔注射等量的生理鹽水；試驗期為7 d。

1.2.2 黃芪多糖生物活性質量判定標準

最后1次注射黃芪多糖24 h后將小鼠頸椎脫臼處死稱取體重，摘取脾臟稱取脾臟重；計算每只小鼠的脾指數，脾指數=脾臟重（mg）/體重（g）；再分別計算試驗組和對照組的平均脾指數。3次重復中只要有1次試驗組與對照組的平均脾指數差值≥2，則可判定樣品合格；若平均脾指數差值＜2，則判定樣品不合格。

1.2.3 數據統計分析

試驗組與對照組各項目間的差異顯著性分析采用t檢驗法；3次重復間的差異顯著性分析和3種樣品間的差異顯著性分析采用單因素方差分析法，多重比較使用SSR法。使用Excel 2010數據分析模塊進行描述統計，結果以“平均值±標準差”表示；使用DPS v 7.05軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1各項目初步統計結果

3種樣品各項目的統計結果見表1。

表1 3種樣品3次重復各項目測定結果

從表1可以看出，試驗組體重小于對照組，樣品A和樣品B的3次重復中各有1次差異極顯著（P＜0.01），而樣品C差異不顯著（P＞0.05）。從脾重和脾指數2項試驗組與對照組的比較來看，樣品A 3次重復中有2次脾指數差異極顯著（P＜0.01），脾重有1次差異極顯著（P＜0.01）；樣品B有1次脾指數差異顯著（P＜0.05），脾重差異不顯著（P＞0.05）；樣品C脾指數差異不顯著（P＞0.05），但有1次脾重差異顯著（P＜0.05）。

從試驗組與對照組脾指數的差值大小作判斷，3種樣品3次重復中各有1次差值大于2，所以可判定3種黃芪多糖樣品均合格。

2.2試驗組3次重復間的比較

試驗組各項目3次重復間方差分析結果表明，樣品A在體重間和脾重間差異均不顯著（P＞0.05），脾指數間差異顯著（P＜0.05）；樣品B在體重間和脾指數間差異均不顯著（P＞0.05），脾重間差異顯著（P＜0.05）；樣品C在體重間、脾重間和脾指數間均差異不顯著（P＞0.05）。差異顯著項多重比較結果見表2。

表2 各項目3次重復間的比較

由表2可知，樣品A脾指數重復A1與重復A2間差異極顯著（P＜0.01），重復A2與重復A3間差異顯著（P＜0.05），重復A1與重復A3間差異不顯著（P＞0.05）；樣品B脾重重復B1與重復B2、B3間均差異顯著（P＜0.05），重復B2與重復B3間差異不顯著（P＞0.05）；其余各項目比較均差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 3種樣品間的比較

3種樣品試驗組各項目方差分析結果顯示，體重間和脾指數間均差異極顯著（P＜0.01），脾重間差異顯著（P＜0.05）；對照組各項目方差分析結果顯示，體重間、脾重間和脾指數間均差異極顯著（P＜0.01）；各項目的多重比較情況見表3。

表3 各項目3種樣品間的比較

從表3可見，試驗組體重樣品A、C與樣品B間差異極顯著（P＜0.01），樣品A與樣品C間差異不顯著（P＞0.05）；脾重樣品A與樣品B、C間差異顯著（P＜0.05），樣品B與樣品C間差異不顯著（P＞0.05）；脾指數樣品A與樣品B、C間的差異極顯著（P＜0.01），樣品B與樣品C間差異不顯著（P＞0.05）。3個對照組間各項目的多重比較也存在極顯著差異（P＜0.01）和顯著差異（P＜0.05）的情況。

3 討論與結論

3.1從試驗組與對照組的比較來看，樣品A和樣品B脾指數均差異極顯著（P＜0.01），樣品C脾重差異顯著（P＜0.05），差異顯著性檢驗結果基本支持黃芪多糖生物活性檢測結果，說明黃芪多糖具有促進小鼠脾臟生長的作用，這與元雪湞等[11]的

研究結論一致；而試驗組體重均小于對照組，此表現也與元雪湞等[11]報道的結果一致?？梢?，本試驗結果可以對現行黃芪多糖生物活性檢測方法的可行性提供支持，但不能作為黃芪多糖促進動物生長的證據。試驗組小鼠體重小于對照組的可能原因，一是預試期較短小鼠對注射黃芪多糖會有應激反應；二是試驗期較短，黃芪多糖的促生長作用還沒有充分發揮出來；三是其他因素造成隨機誤差的影響等。

3.2從3次重復間的比較來看，只有樣品A的脾指數間存在極顯著差異（P＜0.01）、樣品B的脾重間存在顯著差異（P＜0.05），其余各項均差異不顯著（P＞0.05）。說明試驗組小鼠一方面長勢均衡，試驗控制良好；另一方面由于性別、年齡和初始體重等因素使小鼠對黃芪多糖的反應存在個體差異，這也是誤差的重要來源。而本試驗進行3次重復正可以降低試驗誤差，提高黃芪多糖生物活性檢測的可靠性。

3.3從3種樣品間各項目的比較來看，試驗組體重間和脾指數間均存在極顯著差異（P＜0.01），脾重間存在顯著差異（P＜0.05），說明盡管3種樣品檢測結果均為合格，但是3種樣品的生物學效價有所不同。這種差異可從小鼠體重、脾重及脾指數上反應出來，在3次重復間比較時，9項中只有2項差異達到顯著水平，而在3種樣品間比較時，試驗組3個項目全部達到顯著水平。3種樣品間存在較大差異性的原因可能是3種樣品來自不同的獸藥生產廠家，其生產原料、生產條件和生產工藝等不同所造成。3個對照組各項目的差異性可能與購買小鼠批次不同、試驗時間不同有關，除了試驗誤差之外不排除有系統誤差的影響。

3.4現行黃芪多糖生物活性檢測是按照《中國獸藥典2015版（二部）》載明的方法進行的，但藥典上提供的方法只是原則性描述，并沒有具體的試驗設計及誤差控制辦法。在實際檢測中為了控制試驗誤差，陳明志等[8]對試驗動物的初始體重和性別進行分層處理后再進行隨機分組，丘成楨等[9]通過延長預試期和用濾紙吸附脾臟表面血污后稱重，黃志遠等[18]從小鼠飼養管理方面排除誤差干擾，這些都是有益的探索。丘成楨等[9]認為若適應性喂養時間過短小鼠處于應激狀態，會影響機體對黃芪多糖的反應，但適應性喂養時間過長可能導致小鼠對黃芪多糖的敏感性下降。關于試驗誤差控制問題有待進一步研究。