雌激素通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號轉導途徑對鈣誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化的影響△

吳新華，萬家溪，劉 宏，陳章榮，楊 偉，趙秋燕

（1.大理大學第一附屬醫院心內科，云南大理 671000；2.云南省跨高原心血管疾病防治工程研究中心，云南大理 671000；3.大理大學跨高原心血管疾病防治研究所，云南大理 671000）

冠狀動脈鈣化（coronary artery calcium，CAC）是冠狀動脈粥樣硬化的標志［1］，CAC 與性別有明顯關系。研究表明，未絕經婦女的CAC 程度及發病率明顯低于同齡男性［2］，絕經后女性CAC 與同齡男性無明顯差異［3］。老年女性常有收縮壓增高，脈壓差增大，研究顯示脈壓差增大與CAC 呈正相關［4］。說明雌激素在CAC 的發生、發展過程中發揮著重要的干預作用。本課題前期的動物實驗采用維生素D3 誘導大鼠主動脈平滑肌鈣化，并聯合去勢模型，同時給與雌激素50 μg/kg 進行替代治療，發現雌激素可減少維生素D3 誘導的血管壁鈣鹽沉積。與鈣化組相比，雌激素干預組成骨分化相關蛋白Runx2、骨鈣蛋白（bone gla-protein，BGP）表達下降。以上結果提示雌激素可能是通過Runx2 來影響CAC 的形成，但雌激素如何引起Runx2 改變的分子生物學機制仍不清楚。研究表明，磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-ki?nase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號轉導通路在成骨細胞中的磷酸化和激活Runx2等多種骨分化相關蛋白中起關鍵作用［5］，而雌激素又可通過PI3K/Akt 信號轉導通路的激活來促進腫瘤細胞的增殖、遷移等過程［6］，本課題前期研究發現雌激素可通過抑制Runx2 表達來減輕大鼠的血管鈣化。因此，我們推測雌激素可能通過PI3K/Akt 信號轉導通路降低Runx2 表達。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨細胞轉化過程在CAC中起重要作用，本實驗采用大鼠胸大動脈平滑肌細胞株（A7r5）制作鈣化模型，觀察雌激素干預細胞鈣化情況，明確雌激素影響VSMCs表型轉化的主要信號調節通路。

1 材料和方法

1.1 主要材料

大鼠胸主動脈平滑肌細胞A7r5 來自中國科學院細胞庫。β雌二醇和鈣濃度測定試劑盒為美國sigma aldrich 公司產品，PI3K/Akt 信號轉導通路拮抗劑LY294002 和堿性磷酸酶（alkaline phospha?tase，ALP）檢測試劑盒為中國碧云天公司產品，CaCl2（CaCl2）為中國成都臨江化工廠產品，抗-Runx2 抗體、抗-Akt1/2/3 抗體和抗-磷酸化（phos?phate，p）-Akt 抗體為英國Abcam 公司產品，二抗HRP 為中國Proteintech 公司產品，茜素紅S 染色液為中國Solarbio 公司產品。

1.2 細胞培養方法

細胞培養用DMEM 高糖培養基（含有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素），于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養，每2 d 更換培養液，生長融合達80%左右時進行傳代培養。

1.3 鈣化模型CaCl2濃度、雌激素干預濃度和時間的確定

根據預實驗結果選擇5 mmol/L 的CaCl2、100 nmol/L 雌激素干預細胞9 d 為最佳干預時間。

1.4 細胞分組方法

將A7r5 細胞隨機分為正常對照組、鈣化組、雌激素干預組（鈣化+雌激素）、雌激素溶媒對照組（鈣化+Eth）、LY294002 干預組（鈣化+LY294002）。鈣化組加入5 mmol/L 的CaCl2溶液，雌激素干預組加入5 mmol/L的CaCl2溶液和100 nmol/L的雌激素，雌激素溶媒對照組加入5 mmol/L 的CaCl2溶液和10 nmmol/L 的乙醇，干預組加入5 mmol/L 的CaCl2溶液和10 μmol/L 的LY294002。

1.5 A7r5 細胞鈣化模型建立方法

分別使用1、5、10 mmol/L 3 種不同濃度的CaCl2溶液與A7r5 細胞共同培養12 d 后行茜素紅染色觀察。

1.6 細胞茜素紅染色方法

細胞鈣化模型誘導分化結束后，棄培養基，95%乙醇固定10 min；磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后加入0.1%茜素紅染色劑1 mL 置于37℃恒溫箱中染色30 min；磷酸鹽緩沖液沖洗后在倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.7 細胞鈣濃度測定方法

細胞鈣化模型誘導分化結束后，用去離子水沖洗，刮下細胞，收集細胞混懸液，完成細胞計數后在超聲波振蕩機中破壞細胞。按照鈣濃度測定試劑盒說明，用酶標儀在575 nm 處測各組OD 值，根據標準品的濃度和OD 值計算出標準曲線的回歸方程式，并計算出樣品濃度。

1.8 堿性磷酸酶活性檢測

細胞鈣化模型誘導分化結束后，用去離子水沖洗，樣品中加入IP 細胞裂解液（無抑制劑），在超聲波裂解機中裂解10 min，隨后離心取上清液；根據ALP 檢測試劑盒說明，用酶標儀在415 nm處測定樣品OD 值，根據標準品的濃度和OD 值計算出標準曲線的回歸方程式，并計算出樣品ALP 活性。

1.9 實時聚合酶鏈反應檢測Runx2 mRNA 的表達水平

引物設計應用primer 5.0 設計，Oligo 7 驗證，交由Invitrogen Custom Primers 公司合成，Runx2 引物設計序列：F（5′-CCTCGAATGGCAGGACGCTA-3′）；R（5′-AGACTCATCCATTCTGCCGCTA-3′）；β-Actin F（5′-TGTGCTGGACTCTGGAGATG-3′）；R（5′-GAAGGAATAGCCACGCTCAG-3′）。具體步驟：總RNA 提取，總RNA 完整性、濃度和純度測定，反轉錄［所得RNA 與Mix 混合離心后置于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀中央區42 ℃，15 min；95 ℃，3 min，獲得cDNA］，qPCR實驗（qPCR 反應體系配制+qPCR 反應程序設置）。

1.10 Western blot 法檢測方法

具體步驟如下：總蛋白提取，測定總蛋白濃度（BCA 微管測定法），制膠，上樣及電泳，轉膜（半干轉），應用1×TBST 洗膜3 次（搖床10 min、10 min、5 min），脫脂牛奶4℃封閉過夜，加入一抗（Runx2為1∶1 000；Akt 為1∶1 000；P-Akt 為1∶1 000），4℃孵育8 h，回收一抗，加入二抗（1∶5 000），孵育盒放在搖床上4℃孵育80 min，化學發光與曝光。

1.11 統計學分析

所有數據采用SPSS 21.0 統計學軟件進行分析。正態分布的計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建立鈣化模型的CaCl2溶液濃度確定結果

與正常對照組細胞比較，隨CaCl2溶液濃度升高，實驗組橘紅色鈣化結節逐漸增多。CaCl2溶液濃度為5 mmol/L 時的細胞鈣化明顯，且細胞成活率高；而濃度為10 mmol/L 時，雖然鈣化明顯，但細胞成活率低。故后續實驗選用5 mmol/L CaCl2溶液進行鈣化模型建立。鈣化模型成功標志是可見實驗組大量鈣化結節，茜素紅染色后鈣化細胞呈紅色，并分布于整個細胞，對照組沒有附著紅色染料，實驗組細胞在鈣化誘導條件下有鈣鹽沉積。

圖1 不同鈣化時間組細胞鈣化結節光學顯微鏡下圖片比較 ［×40，茜素紅染色；A 為正常對照組；B 為5 mmol/L CaCl2溶液鈣化組（6 d）；C 為5 mmol/L CaCl2溶液鈣化組（9 d）；D 為5 mmol/L CaCl2溶液鈣化組（12 d）］

2.2 不同CaCl2溶液濃度及干預時間組細胞鈣濃度及堿性磷酸酶活性比較

隨著培養基中CaCl2溶液濃度的增高，細胞鈣濃度及ALP 活性逐漸升高（圖2a、圖2b）。當培養基中CaCl2溶液濃度為1 mmol/L時，細胞的ALP活性與正常對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；當培養基中CaCl2溶液濃度達到10 mmol/L 時，鈣濃度較5 mmol/L 時升高已不明顯。使用5 mmol/L CaCl2溶液分別在6、9、12 d 測定細胞鈣濃度及ALP 活性，發現鈣化組較正常對照組細胞鈣濃度及ALP 活性明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。細胞鈣濃度及ALP 隨著培養時間延長而增高（圖2c、圖2d）。當培養時間為6 d 時，細胞的ALP 活性與正常對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；當培養時間達到12 d 時，細胞鈣濃度及ALP 活性較9 d 時升高已不明顯（P>0.05）。

圖2 不同CaCl2溶液濃度及干預時間組細胞鈣濃度及ALP 活性比較柱狀圖

2.3 不同雌激素濃度組細胞鈣濃度及堿性磷酸酶活性比較

分別使用10、100、1 000 nmol/L 濃度的雌激素對5 mmol/L CaCl2溶液建立的鈣化模型進行干預，在干預的第9 天，與鈣化對照組相比，雌激素干預組茜素紅染色鈣化結節減少，100 nmol/L 濃度時鈣化減輕明顯且細胞成活率高。不同濃度雌激素干預組細胞鈣濃度及ALP活性均明顯下降（P<0.01），其中鈣化+雌激素（100 nmol/L）組的抑制效果最理想（圖3 和圖4）。

圖3 不同雌激素濃度組A7r5 細胞鈣化程度光學顯微鏡下圖像比較（×100，茜素紅染色）

圖4 不同雌激素濃度組A7r5 細胞鈣濃度及ALP 活性比較柱狀圖

2.4 各組細胞鈣濃度及堿性磷酸酶活性比較

與對照組比較，鈣化組細胞鈣濃度、ALP 活性明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與鈣化組相比，雌激素干預組（100 nmol/L）細胞有抑制鈣鹽沉積的效果，差異有統計學意義（P<0.01）。LY294002 干預組細胞ALP 活性較鈣化組降低，差異有統計學意義（P<0.05），但兩組鈣濃度比較差異無統計學意義（P>0.05）。雌激素溶媒對照組細胞鈣濃度和ALP 活性與鈣化組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。各組細胞鈣濃度及ALP 活性比較見圖5 和圖6。

圖5 各組A7r5 細胞鈣化程度光學顯微鏡下圖像比較（茜素紅染色）

圖6 各組A7r5 細胞鈣濃度及ALP 活性比較柱狀圖

2.5 各組細胞Akt 蛋白表達水平和Runx2 表達水平比較

雌激素干預組、LY294002干預組與對照組細胞的p-Akt 蛋白表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）；鈣化組細胞與對照組比較，p-Akt 蛋白表達顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）。與鈣化組比較，雌激素干預組和LY294002干預組p-Akt蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。與對照組對比，鈣化組Runx2 mRNA 和蛋白表達水平顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）。與鈣化組相比，雌激素干預組和LY294002 干預組Runx2 mRNA 和蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；雌激素溶媒對照組Runx2 mRNA 和蛋白表達水平與鈣化組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。各組細胞Akt 蛋白表達水平和Runx2 表達水平比較，見圖7。

圖7 各組細胞Akt 蛋白表達水平和Runx2 表達水平比較柱狀圖（a 為各組Runx2 mRNA 比較；b 為各組細胞T-Akt、p-Akt、Runx2 電泳凝膠圖像；c 為各組細胞p-Akt 蛋白表達水平比較；d 為各組細胞Runx2 蛋白表達比較）

3 討論

CaCl2溶液是最常用誘導細胞鈣化的制劑之一，誘導細胞鈣化時間為8～14 d［7-8］。本實驗確定CaCl2溶液制作細胞鈣化模型最佳濃度為5 mmol/l，誘導鈣化最佳時間為9 d。

本實驗對鈣化細胞進行雌激素濃度干預梯度實驗，發現鈣離子濃度及ALP 活性顯著下降，說明雌激素通過降低鈣離子和ALP 活性來抑制血管鈣化，且雌激素抑制效果隨著濃度升高而增強。雌激素不僅是影響成骨細胞表型轉化的重要激素，還是減輕CAC 的內源性保護物質。但隨著雌激素濃度繼續增加，相應的細胞鈣離子濃度及ALP 活性未有相應的明顯下降，考慮這與高濃度雌激素對細胞的毒性作用增強有關。本實驗結果顯示雌激素最佳干預濃度及時間與Nanao 等［9］使用雌激素（終濃度100 nmol/L）干預無機磷誘導的血管平滑肌鈣化實驗得到的結果一致。

本研究結果顯示，當誘導細胞鈣化后，Runx2基因及蛋白水平明顯上升，說明Runx2 與血管鈣化密切相關。Hyun 等［10］研究發現，過氧化氫促進VSMCs 從收縮型到成骨表型的表型轉換過程需要Runx2 介導，從而影響其下游的ALP、OC、SM22a等骨、平滑肌細胞形成標志物，進而影響鈣化形成。同時，使用腺病毒轉染VSMCs 使Runx2 過度表達，發現鈣化也同步增加。本研究結果與上述結果相似。當使用雌激素干預鈣化的VSMCs 后，細胞的Runx2 mRNA 及Runx2 蛋白表達水平的表達降低，說明雌激素降低細胞鈣化水平是通過降低Runx2 的表達實現。Osako 等［11］研究表明，在人類VSMCs，雌激素可以通過ERα 抑制RANKL 信號，降低Runx2 mRNA 水平，最終影響鈣化形成。在成骨分化過程中，Runx2 受P13K/Ak t 信號通路調節［12］。在氧化應激誘導的VSMCs 鈣化過程中，Runx2 是一個關鍵調節因子，受到PI3K/Akt 通路的調節［10］，我們推測雌激素可能是通過PI3K/Akt 信號轉導通路來影響Runx2 的表達從而發揮這種抑制作用。

為了進一步明確上述猜測，本研究使用PI3K/Akt 信號轉導通路抑制劑（LY294002）干預，測定P-Akt、Runx2 表達情況和對細胞鈣化的影響。本實驗結果顯示，當誘導細胞鈣化后，鈣化組的PAkt 蛋白水平較正常對照組明顯上升，說明PI3K/Akt 信號轉導通路的激活可以促進VSMCs 鈣化。在使用雌激素干預后，發現雌激素降低了鈣化細胞中的Runx2、P-Akt蛋白水平表達；加入LY294002后，Runx2、P-Akt蛋白水平明顯下降，這說明雌激素與LY294002 有相同的作用，證明雌激素是通過抑制PI3K/Akt 信號轉導通路下調Runx2 的表達，從而達到抑制VSMCs 鈣化的目的。研究發現PI3K/Akt信號轉導通路在鈣化過程中起重要作用，Chang等［13］在大鼠血管平滑肌中使用鈣磷誘導鈣化后，發現鈣化組信號轉導通路調節蛋白P-Akt 活化，提示P13K/Akt 信號轉導通路的激活可以促進鈣磷誘導的VSMCs 向成骨表型轉化。Liang 等［14］研究表明，Akt 可增強叉頭蛋白（FOXO）的磷酸化，調節Runx2的泛素化，增強Runx2表達，從而導致VSMCs鈣化。這都與本實驗的結論一致。無論雌激素還是PI3K/Akt 抑制劑干預，總Akt 水平均無變化，而p-Akt 蛋白水平明顯降低，Runx2 表達也相應降低，說明雌激素及LY294002 主要影響Akt 磷酸化。有研究表明，PI3K/Akt 通路參與Runx2 依賴的成骨分化、軟骨分化，使用LY294002 后Akt 去磷酸化，成骨作用被抑制［10，12］。Akt 活化能增強叉頭蛋白的磷酸化，調節Runx2 的泛素化，減少Runx2降解，從而導致VSMCs鈣化［14］。

綜上所述，本研究在體外VSMCs 鈣化模型中發現，雌激素抑制VSMCs 鈣化是通過PI3K/Akt 信號轉導通路來降低Runx2 的表達進行調節。但雌激素對心血管系統的保護作用機制非常多，涉及多通路、多靶點，本研究也只探討了其中一條通路，完整的作用機制仍需進一步深入研究。本研究探討了雌激素在血管鈣化中所發揮的保護作用及其分子生物學機制，為治療心血管疾病提供新的思路與靶點。