女貞種質資源ISSR分析與抗寒優株選育

姜楠南，孫 音，劉鳳欒，王 媛，盧 潔，楊傳祥，房義福

（1.山東省林業科學研究院 園林與花卉所，山東 濟南 250014；2.上海辰山植物園中國科學院上海辰山植物科學研究中心，上海 201602；3.山東省林木種苗和花卉站，山東 濟南 250014；4.泰禾園林綠化有限公司，山東 日照 276800）

女貞Ligustrum lucidum為木犀科Oleaceae 女貞屬Ligustrum常綠闊葉小喬木，其樹形優美、葉片光亮、果實累累，具有良好的園林應用價值和較高的藥用價值[1]。女貞原產于我國長江流域及其以南的華南、西南地區，分布廣泛，西北至陜西、甘肅，東到江蘇，朝鮮也有分布[2]。女貞適應性強，對低溫低濕環境及鉛、鉻、鋅、二氧化硫等污染具有較強的耐受性[3]。由于其葉片大且光亮、經冬不落，近年來被大量引種到我國黃河中下游地區，是山東、河南、河北等黃河中下游地區為數不多的常綠闊葉喬木樹種，在隆冬時節其觀賞性狀突出。但是引入山東及其周邊地區后易受凍害，表現為冬末全部或大部分葉片枯黃脫落并保持落葉狀態，直至來年新葉萌生，甚至1年生枝條凍死或地上枝干全部凍死等。因而選育適應北方地區氣候的抗寒女貞優株，對于華北地區的生態建設和綠化美化具有十分重要的意義。

近年來，關于女貞抗寒性鑒定方法及生理生化指標測定的研究多有報道。林艷等[4]、李忠喜等[5]以相對電導率為指標篩選抗寒女貞；郝明灼等[6]對4 個女貞品種盆栽苗抽梢展葉期的抗寒性進行研究，利用Logistic 方程擬合得出女貞的低溫半致死溫度為-5.69 ℃。植物在不同物候期的抗寒能力存在較為明顯的差異[7]。楊曉玲等[8]對3 種女貞的葉片抗寒、抗旱生理指標進行了研究，認為女貞的抗低溫和抗干旱能力較強。林艷等[9]經研究發現，相對較高的溫度和濕度可降低女貞主干抽梢率，增強女貞的抗寒性能。上述文獻均以電導率為指標研究了不同品種、不同樹齡、不同環境條件下女貞的抗寒性?？购允侵参镌趯Φ蜏氐拈L期適應中通過本身的變異和自然選擇獲得的一種遺傳特性。女貞的抗寒性由其在低溫脅迫下的生理調節能力決定，生理調節能力與植株的遺傳特性、解剖結構、環境及當年生長發育情況等有關[10]。前期研究結果表明，部分抗寒女貞優株的抗寒表現不穩定，可塑性較大。目前，對女貞抗寒穩定性進行多年連續觀測的研究報道較少，將抗寒表型與生理指標、解剖、遺傳相結合的研究鮮見報道。

本課題組連續多年觀察篩選引入的女貞，淘汰凍死凍傷女貞種質，初步篩選出抗寒表現較好的60 份女貞種質。由于女貞抗寒表現具有不穩定性，為了從中篩選出抗寒性強且穩定的女貞種質，課題組對初選的60 份女貞種質，在連續調查其露地越冬表現的同時，采集具有不同抗寒表現的葉片觀察葉脈和葉肉的解剖結構，采集1年生枝條測定電導率，計算脅迫條件下的低溫半致死溫度，綜合評價各女貞種質的抗寒能力。采用ISSR（inter-simple sequence repeats）分子標記的方式，對60 份女貞種質進行遺傳多樣性分析，將女貞種質的聚類結果和抗寒能力進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于山東省濟南市長清區（116°63′E，36°38′N）。2016年，平均氣溫13.8 ℃，年平均降水量623.1 mm，無霜期186 d，1月平均氣溫-3.2 ℃，極端最低氣溫-16 ℃（1月20日）。

1.2 供試材料

從山東、河南、河北、四川等地栽植的女貞中收集抗寒種質資源共185 份，2010年進行嫁接繁殖，2011年定植在長清區試驗地。2017年，選擇不同來源且具有代表性的60 份材料作為試驗材料（表1）。其中，D5、D6、D7 為B3 的實生苗后代。

表1 60 份女貞種質材料及其來源Table 1 60 germplasm materials of L.lucidum and their origins

1.3 試驗方法

1.3.1 女貞抗寒表型觀測

2011—2017年的每年3月（女貞換葉期），調查女貞露地越冬表現，統計主干、枝條受凍情況和葉片枯落情況。

1.3.2 葉片解剖結構觀察

2017年1月，采集各女貞種質材料的葉片，采用石蠟切片法[11]制作切片，切片厚度8 μm，番紅-固綠染色，使用奧林巴斯B50 顯微鏡觀察并拍照。比較葉片主葉脈、柵欄組織和海綿組織等的差異，分析其與抗寒能力的相關性。

1.3.3 相對電導率測定及低溫半致死溫度計算

2017年11月初，采集各女貞種質材料相對飽滿健壯的1年生休眠枝條，剪成10 cm 長度，隨機分成5 份，裝入自封袋中，于4 ℃條件下平衡24 h，然后分別置于0、-5、-10、-15 和-20 ℃條件下處理12 h。每份樣品避開兩端及芽眼，剪成約0.3 cm 長度枝段，室溫下浸提12 h 后，測定初電導值（S1），煮沸30 min，冷卻至室溫后，測定終電導值（S2）。室溫下測定去離子水電導值（S0）[12]，計算相對電導率（SR）。

SR= [(S1-S0)/(S2-S0)]×100%。

古人說，心安茅屋穩，性定菜根香，心安即是福。是的，抬腿之勞，一個小小過失的彌補，便能讓人心安，便能讓人感念生活，感悟人生，便能讓世界充滿愛，于人于己都是滿滿的正能量，何樂而不為呢？！

使用SPSS 軟件擬合Logistic 回歸方程

y=k/(1+ae-bt)。

式中：y為相對電導率，x為處理溫度，k為常數。計算相對電導率的拐點溫度lna/b，即低溫半致死溫度[13]。

1.3.4 ISSR 分子標記及聚類

采用改良的CTAB 法[14]抽提各女貞種質材料的總基因組DNA，采用ISSR 分子標記的方法，使用優化的ISSR-PCR 反應體系[15]，對96 條哥倫比亞大學開發的通用引物進行篩選用于PCR 擴增。使用POPGENE 軟件計算多態位點百分率。

將電泳圖譜同一位置清晰出現的條帶記為“1”，無條帶記為“0”，將條帶信息轉換成“0”和“1”組成的原始矩陣，使用NTSYSpc-2.11F 軟件進行數據分析。對原始矩陣用SimQual 程序求DICE 相似系數矩陣，并獲得相似系數矩陣。依據Nei’s 遺傳距離，采用SHAN 程序中的UPGMA 方法進行聚類分析，通過Tree plot 模塊生成聚類圖，構建各種質材料間的親緣關系。

2 結果與分析

2.1 各女貞種質材料的抗寒表型分級

2014—2017年，每年11月15日—次年3月15日長清區日最低溫度變化如圖1所示。

圖1 2014—2017年女貞越冬期間長清區日最低溫度的變化Fig.1 Daily mininmum temperature changes of Changqing district sites during the L.lucidum through winter from 2014 to 2017

表2 60 份女貞種質材料抗寒表型分級Table 2 Classification of cold resistant phenotype of 60 L.lucidum germplasm materials

2.2 各女貞種質材料的葉片解剖結構

選擇越冬葉片保有率較高的女貞種質A4、A5和越冬葉片保有率較低的女貞種質K1、K3，觀察其葉片主脈解剖結構，如圖2所示。由圖2可見，具有較高與較低越冬葉片保有率種質的主葉脈結構無顯著差異，其木質部、韌皮部細胞層數接近，細胞大小及排列方式較為相似。

圖2 具有不同越冬葉片保有率女貞種質的葉片主脈解剖結構Fig.2 Anatomical structure of leaf main veins of L.lucidum germplasm with different leaf retention rates over winter

選擇越冬葉片保有率較高的女貞種質A4、A5和越冬葉片保有率較低的女貞種質K1、K3，觀察其葉肉組織解剖結構，如圖3所示。由圖3可見，越冬葉片保有率較高的女貞種質A4、A5，其葉片的柵欄組織和海綿組織在細胞層數、細胞排列緊密度、細胞完整度等方面顯著優于越冬葉片保有率較低的女貞種質K1、K3。

圖3 具有不同越冬葉片保有率女貞種質的葉肉組織解剖結構Fig.3 Anatomical structure of mesophyll tissue of L.lucidum germplasm with different leaf retention rates over winter

抗寒種質A4 的葉片柵欄組織多達3 層，柵欄組織厚度達425.2 μm，細胞完整性高、排列緊密，海綿組織細胞解體少、排列緊密，海綿組織厚度297.5 μm，柵欄組織和海綿組織厚度的比值為1.43。越冬葉片保有率較低的種質K3 的葉片柵欄組織厚度僅為198.6 μm，海綿組織細胞排列疏松，海綿組織厚度達435 μm，柵欄組織和海綿組織厚度的比值為0.46。

2.3 各女貞種質材料的低溫半致死溫度

以60 份女貞種質1年生枝為材料，測定相對電導率，推導Logistic 回歸方程，計算低溫半致死溫度，結果見表3。由表3可知，60 份女貞材料的低溫半致死溫度與其抗寒表現較為相符，其中種質A4 的低溫半致死溫度最低，為-15.1 ℃。

表3 60 份女貞種質材料的低溫半致死溫度Table 3 Semi-lethal low temperature of 60 L.lucidum materials ℃

2.4 各女貞種質材料的ISSR 分子標記和聚類分析

2.4.1 ISSR 引物篩選及擴增產物的多態性

從96 條ISSR 引物中篩選出9 條擴增條帶較完整、清晰、多態性豐畗的引物，分別為UBC807、UBC808、UBC810、UBC811、UBC836、UBC840、UBC880、UBC881 和UBC886。所篩選9 條ISSR 引物對60 份女貞種質材料的擴增結果見表4。由表4可知，這9 條引物的平均擴增多態性位點數為224，多態性位點比率達100%。多態性水平無明顯差異，擴增的DNA片段集中在200～1 000 bp，60 份女貞種質材料的Nei’s 基因多樣性指數為0.116 3～0.172 1，平均為0.143 8；Shannon 信息指數為0.206 0～0.295 3，平均為0.254 5。

表4 所篩選9 條ISSR 引物對60 份女貞種質材料的擴增結果Table 4 Amplification results of the 9 ISSR primers to 60 L.lucidum materials

使用這9 條引物擴增出的DNA 片段長度基本相同，重復性較高，說明引物的重復性好，可以用于遺傳多樣性分析。其中，引物UBC808 多態性擴增效果最好（圖4），其次是UBC836。

圖4 使用引物UBC808 擴增的60 份女貞種質材料的ISSR 圖譜（PAGE）Fig.4 ISSR map of 60 L.lucidum germplasm materials amplified with primer UBC808（PAGE）

2.4.2 ISSR 標記聚類分析

根據遺傳相似系數矩陣，對60 份女貞種質材料進行UPGMA聚類，結果如圖5所示。由圖5可見，以相似系數0.298 為界，可將供試樣品分為i 和ii 2 大類。i 類中，A8、A10 首先聚在一起，之后與A12、A14 聚在一起，然后與A4、A5 以及A3 聚在一起，A11 和K12 相聚再與前面的種質聚在一起；B6、B8 親緣關系最近，然后與CX6 相聚；B9、B10 相聚再與B1 相聚。其余的種質聚成ⅱ類。根據表1中女貞種質來源可知，不同種源地的種質可以聚在一起，如A8 和A10；同一種源地的種質不一定聚在一起，同為鄢陵來源的A3、A4、A5聚在ⅰ類，A6、A7 聚在ⅱ類。

圖5 60 份女貞種質材料基于ISSR 的遺傳相似性的UPGMA 聚類Fig.5 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 60 L.lucidum materials

3 結論與討論

女貞葉肉組織顯微結構、低溫半致死溫度和抗寒表型觀測結果均顯示優株A4 的抗寒性強且穩定，是良好的抗寒女貞育種材料。供試女貞材料的ISSR 聚類結果反映了其親緣關系，也表明不能按照優株地理距離聚類。ISSR 聚類結果與抗寒性表現相符，表明親緣關系近的女貞種質具有相似的抗寒表現。

3.1 ISSR 聚類分析

趙峰等[16]將RAPD 技術應用于女貞種內遺傳多樣性分析，將7 個居群的121 份女貞材料按照地理來源分為4 大類群。李傳代[17]應用ISSR 分子標記將66 份女貞種質分為4 類，親緣關系遠近與地理位置遠近的格局不完全吻合。本試驗中60份女貞供試材料來自河南、山東、河北、四川等地，ISSR 聚類結果顯示大部分女貞種質可按照地域聚在一起，但存在不同取樣地的女貞材料未按照地理距離聚類的情況，親緣關系與取樣地域不完全吻合。D5、D6、D7 均為B3 結實播種所得后代，親緣關系近，聚在一起，說明ISSR 聚類結果反映了其親緣關系，印證了ISSR 聚類的可信性。本試驗中取樣材料雖然來自不同省份，但這些省份大多數不是女貞的原產地，當地女貞多是自外地引種而來。李傳代等[15]從云南、貴州、江西、湖南、江蘇女貞居群中取樣，得到的Nei’s 基因多樣性指數均值為0.200 5，Shannon 信息指數均值為0.315 1，這2 個衡量遺傳多樣性的指標均高于本試驗結果。表明本試驗中所選取女貞種質材料間的遺傳變異小于野生分布種群，這與試驗取樣不是來自野生居群有關，這在高粱[18]、向日葵[19]、大豆[20]等物種上得到證實。

3.2 抗寒女貞優株篩選

大量研究結果表明，采用電導法測定一系列溫度下植物組織的電導率，采用Logistic 方程進行回歸分析，通過計算得到的植物組織低溫半致死溫度可以作為抗寒性指標[4-5,21-23]。本試驗中通過比較不同女貞材料枝條的低溫半致死溫度，發現其抗寒性存在明顯差異，優株A4 的低溫半致死溫度達到-15.1 ℃，而抗寒性較弱的種質K1 的低溫半致死溫度為-4.2 ℃。除K1、K4 外，其余優株均比朱鳳榮等[24]測定的河南新鄉女貞的低溫半致死溫度（-5.316 ℃）低，一定程度上說明本試驗中所篩選優株的抗寒性整體較強。葉片解剖結構也是反映抗寒性的指標[25]。優株A4 休眠枝條的低溫半致死溫度為-15.1 ℃，與K1、K3 相比，其葉肉組織解剖結構中柵欄組織細胞層數多、排列緊密，柵欄組織和海綿組織厚度的比值大，說明A4抗寒性強與葉片組織結構有關。將ISSR 聚類結果與2015—2017年的抗寒表型觀測結果相比較可知，ISSR 聚類結果中，ⅰ類種質的抗寒表型多為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級，其中A4、A12 的抗寒表型為Ⅰ級，僅A14的抗寒表型為Ⅳ級。ⅱ類種質的抗寒表型以Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級為多，也包括部分抗寒表型Ⅱ級的女貞種質。將ISSR 聚類結果與低溫半致死溫度相比較可以看出，ⅰ類種質包含15 個優株，其中10 個優株的低溫半致死溫度在-10 ℃以下，抗寒能力強，A4 的低溫半致死溫度最低，而ⅱ類種質的低溫半致死溫度較高。結合2015—2017年女貞抗寒表型觀測結果可發現，ⅰ類女貞種質抗寒性較強，ⅱ類女貞種質抗寒性較弱。在進行抗寒女貞雜交育種時，應選擇抗寒強的ⅰ類女貞種質為親本。

盡管本試驗中所選取抗寒指標在多數情況下與抗寒表型觀測結果相符，但部分材料存在出入，如A12 的抗寒表型為Ⅰ級，但其低溫半致死溫度較高（-11 ℃），說明抗寒女貞篩選的復雜性，單憑幾年時間的觀測進行抗寒優株篩選，其結果不可靠。由于抗寒表型具有不穩定的特點，各種抗寒性篩選指標均有其局限性，單一指標難以準確全面地反映植物的抗寒性[26]，將抗寒表型、生理指標、植物組織結構與由分子標記得出的親緣關系相結合，來篩選抗寒女貞優株，可增強篩選結果的可靠性，得出更為科學的結論。2016年1月，試驗地最低溫度達到-19.7 ℃，優株A4 的主干和1年生、2年生枝基本未受凍害，其余女貞地上部均呈現不同程度凍害。優株A4 在自然極寒天氣的表現與低溫半致死溫度、葉片解剖結構等抗寒指標及ISSR 聚類結果相互印證，說明其抗寒性較強，可作為抗寒女貞種質在華北地區推廣。

植物的抗寒性是其南種北引的主要限制因子，而植物是否真正適應引種地環境，需要幾十甚至上百年時間的檢驗。本研究雖持續7 a，但篩選出的抗寒常綠女貞優株的抗寒表現仍有待時間的檢驗。除種內選育外，開展種間雜交育種是未來培育抗寒女貞優株的研究方向。