卵巢上皮性癌中VEGF、CD4+、CD8+及COX?2表達與TIDC相關性

吳明燕 康雪芳 林月麗 林也容 張蘭 黃麗玲 陳慧

作者單位：中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○九醫院婦產科，福建，漳州363000

卵巢上皮性癌約占女性惡性腫瘤的3%～4%，具有高死亡率、高發病率的特點［1］。腫瘤細胞的快速生長與轉移是導致患者預后不良的主要危險因素，目前已有研究證實，腫瘤快速生長與轉移及免疫抑制有關［2］。T 淋巴細胞介導的細胞免疫在機體排斥腫瘤細胞時起主要作用，但腫瘤抗原只有經抗原遞呈細胞的抗原遞呈后才能被T 淋巴細胞識別。當今免疫學研究認為，機體處于免疫激活或免疫抑制依賴于抗原呈遞細胞（Antigen presenting cell，APC）的抗原遞呈功能［3］。人體內功能最強的專職APC 為樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）。腫瘤組織局部浸潤的DC 稱為腫瘤浸潤性DC（Tumor invasive DC，TIDC），其能真實反映組織局部的免疫狀態［4］。組織中環氧合酶?2（Cyclooxygenase?2，COX?2）、血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）等因子均與TIDC 的分化、成熟有關［5］。本研究將通過分析卵巢上皮性癌中VEGF、CD4+、CD8+及COX?2 表達與TIDC 的關系，探討卵巢上皮性癌局部免疫功能抑制的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年12月至2020年1月收治的110 例卵巢上皮性癌患者作為研究組。納入指標：①均符合卵巢上皮性癌的診斷標準［6］；②自愿參與本次研究，且簽署知情同意書者；③臨床資料無缺失或丟失；④未進行化療、放療等治療者。排除標準：①心臟、肝腎功能不全；②神經功能障礙者；③合并其他惡性疾??；④哺乳期婦女或妊娠期孕婦。平均年齡為（51.98±10.74）歲；臨床分期：Ⅰ期30 例，Ⅱ期33 例，Ⅲ期30 例，Ⅳ期17 例；病理類型：漿液性癌81 例，黏液性癌29 例；伴有腹水者41 例；病理分級G139 例，G237 例，G334 例。另同期選取進行健康體檢的70 例女性體檢者作為對照組，平均年齡為（50.87±9.36）歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準通過。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

一抗均為濃縮型，鼠抗人S?100 單克隆抗體，購自美國Neomarkers 公司。鼠抗人VEGF、COX?2 單克隆抗體，購自美國Santa Cruz 公司。鏈酶菌抗生物素蛋白?過氧化物酶連接（SP）免疫組化超敏試劑盒、胰蛋白酶及二氨基聯苯氨酶底物顯色試劑盒，購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2 檢測方法

首先進行標本準備：組織切片后脫蠟、水化。然后根據S?P 免疫組化染色法對S?100、VEGF 及COX?2 進行檢測，檢測過程嚴格按照說明進行。一抗陰性對照使用PBS（磷酸鹽緩沖液）進行代替。

1.2.3 結果判斷［7］

根據S?100、VEGF 及COX?2 陽性細胞百分比、染色強度判定。分為：0 分、1 分、2 分、3 分、4 分。染色強度判定：0 分：無色，1 分：淡黃色，2 分：棕黃色，3 分：棕褐色?？偡e分：上述2 項評分的乘積。陽性：總積分>4 分。

1.2.4 T 淋巴細胞檢測

空腹抽取所有受檢者3 mL 靜脈血，3 500 r/min離心15 min，分離血清，取上清液，置于-80℃低溫保存待檢。采用貝克曼流式細胞儀檢測患者外周血T 淋巴細胞亞群（CD4+、CD8+）。

1.2.5 TIDC 確認標準［8］

TIDC 確認標準：細胞形態完整，細胞核與細胞形態不規則，細胞質可見明顯凸起；S?100 蛋白染色陽性。TIDC 計數：由兩名或以上病理科醫師進行閱片。低倍鏡下任選染色背景清晰處，然后在高倍鏡下任選5 個視野計數TIDC 總數，并計算其平均值，為TIDC 數密度。

1.3 觀察指標

①比較兩組S?100 TIDC 及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+表達情況。②分析卵巢上皮性癌病理特征與TIDC 數密度及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+的關系。③分析VEGF、COX?2、CD4+、CD8+與TIDC 的相關性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；采用Pearson 法對各參數進行相關性分析；以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組S?100 及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+表達情況比較

研究組S?100 及VEGF、COX?2 陽性表達率和CD4+、CD8+水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組S?100 及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+表達情況［n（%），（±s）］Table 1 Expression of S?100 and VEGF，COX?2，CD4+、CD8+in two groups［n（%），（±s）］

表1 兩組S?100 及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+表達情況［n（%），（±s）］Table 1 Expression of S?100 and VEGF，COX?2，CD4+、CD8+in two groups［n（%），（±s）］

組別n S?100陽性陰性VEGF陽性陰性COX?2陽性陰性CD4+CD8+對照組研究組t/χ2值P 值70 110 44（62.86）91（82.73）9.008 0.003 26（37.14）19（17.27）3（4.29）78（70.81）76.718<0.001 67（95.71）32（29.09）4（5.71）83（75.45）83.316<0.001 66（94.29）27（24.55）10.71±6.02 18.77±9.56 6.300<0.001 10.94±6.28 38.95±15.75 14.168<0.001

圖1 免疫組化染色圖（SP，×400）Figure 1 immunohistochemical staining（SP，×400）

2.2 卵巢上皮性癌病理特征與TIDC 數密度及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+的關系

臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有腹水者TIDC 數密度明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無腹水者，差異有統計學意義（P<0.05）。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、病理分級G3者VEGF、COX?2 陽性表達率與Ⅰ～Ⅱ期、G1?G2級者，差異有統計學意義（P<0.05）。漿液性癌患者CD4+水平顯著高于黏液性癌患者，差異有統計學意義（P<0.05）。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有腹水及病理分級G3者CD8+水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無腹水及病理分級G1?G2級者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 卵巢上皮性癌病理特征與TIDC 數密度及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+的關系［（±s），n（%）］Table 2 The relationship between the pathological characteristics of epithelial ovarian cancer and the number density of TIDC，VEGF，COX?2，CD4+，CD8+［（±s），n（%）］

表2 卵巢上皮性癌病理特征與TIDC 數密度及VEGF、COX?2、CD4+、CD8+的關系［（±s），n（%）］Table 2 The relationship between the pathological characteristics of epithelial ovarian cancer and the number density of TIDC，VEGF，COX?2，CD4+，CD8+［（±s），n（%）］

病理特征年齡n t值P值χ2值P值χ2值P值t值TIDC數密度9.17±2.07 9.71±2.28 8.45±1.56 8.62±1.74 9.74±1.07 9.35±1.48 10.19±2.74 8.04±1.77 7.56±1.26 10.84±3.04 8.15±1.47 8.06±1.14 P值t值VEGF陽性47（72.30）31（68.89）35（74.47）43（68.25）58（71.60）20（68.97）31（49.21）47（100.00）28（68.29）50（72.46）44（57.89）34（100.00）P值0.4510.653 1.2870.201 COX?2陽性49（75.38）34（75.56）37（78.72）46（73.02）60（74.07）23（79.31）38（60.32）45（95.74）30（73.17）53（76.81）51（67.11）32（94.12）3.3290.068 0.4730.491 CD4+14.27±9.77 15.21±4.86 13.56±8.54 12.89±7.98 18.03±8.21 14.98±10.56 17.25±12.37 16.54±11.05 15.97±9.54 14.65±8.06 17.68±12.94 16.99±11.87腫瘤直徑<45歲≥45歲<10 cm≥10 cm漿液性黏液性Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ0.5300.598 0.5530.673 0.0010.984 0.5960.553 0.5040.478 0.2390.812組織學類型1.5150.133 0.0720.788 0.3160.574 0.4230.115 0.1970.845臨床分期4.6950.001 33.6670.001 18.2420.001 0.6730.756 2.3410.021腹水6.5720.001 0.4200.517 0.1840.668 1.5870.440 3.3950.001病理分級有無G1?G2 G3 65 45 47 63 81 29 63 47 41 69 76 34 0.3170.752 20.1890.001 9.2550.002 0.1150.792 CD8+27.90±9.65 28.78±10.65 33.56±18.56 32.74±17.26 34.56±19.56 33.74±18.47 26.87±9.45 31.54±18.05 33.17±20.56 20.77±17.21 26.87±15.56 35.56±18.55 2.5480.012

2.3 VEGF、COX?2、CD4+、CD8+與TIDC 的相關性分析

VEGF、COX?2、CD8+與TIDC 均呈負相關關系（r1=-0.654，r2=-0.584，r3=-0.524，P<0.05），CD4+與TIDC 無顯著相關性（r=-0.112，P>0.05）。

3 討論

腫瘤的發生、發展與機體免疫相關，近些年腫瘤免疫學的發展為臨床診治方面提供了新方向。樹突細胞在腫瘤患者中可作為一種抗原呈遞細胞，刺激細胞毒性T 細胞等的增殖，進而對腫瘤細胞進行殺傷［9?10］。由于體外分離培養TIDC 較困難，因而對TIDC 的研究受到方法學的限制。本研究中采用S?100 蛋白標記卵巢上皮性癌TIDC。大多數TIDC 體積大、樹突較長，分布于腫瘤細胞之間，可通過內胞飲、吞噬等方式攝取卵巢癌抗原［11］。Camerin等［12］研究顯示，分布在腫瘤外圍間質的TIDC 因更靠近淋巴組織，可能處于抗原遞呈階段。本研究中，卵巢上皮性癌患者S?100 陽性表達率顯著高于健康女性，與Roze 等［13］研究報道相符。推測其原因可能是在卵巢上皮性癌抗原的刺激下，循環中的一部分DC趨化到腫瘤微環境中，參與機體免疫應答。

VEGF 是重要的腫瘤血管生成通路，尤其是血管內皮生長因子受體2（Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2），在血管發生和血管生成中起重要作用。COX?2 是一種誘導酶，組織損傷或者患有炎癥的情況下，COX?2 表達會增強。COX?2 可明顯促進VEGF、轉化生長因子β1（Trans?forming growth factor?beta 1，TGF?1）等前血管形成因子的生成。VEGF 可通過骨髓造血前體細胞上的受體血管內皮生長因子受體1（Vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）與VEGFR2 結合，抑制造血前體細胞轉錄因子核因子κB 的激活，阻滯DC 前體細胞向DC 分化，誘導DC 細胞凋亡，進而減少DC 數量。Adler 等［14］研究證實，胃癌組織中VEGF 表達與TIDC 密度呈負相關?；谏鲜鑫墨I結果，本研究推測卵巢上皮性癌中VEGF、COX?2表達可能與TIDC 存在相關性，結果證實，上述因子與TIDC 呈負相關。推測可能是卵巢癌組織中高水平VEGF、COX?2 抑制了TIDC 的分化。

在控制具有免疫原性腫瘤細胞生長過程中，T 細胞介導的免疫應答最為重要。T 細胞亞群主要包括CD8+、CD4+，前者可直接作為效應細胞特異性殺傷癌細胞，后者則主要分泌細胞因子調節腫瘤免疫。Mrch 等［15］研究發現，卵巢上皮性癌中，CD8+、CD4+表達與正常卵巢組織比較差異具有統計學意義，且在Ⅲ～Ⅳ期、G3中表達明顯下降。本研究與上述報道一致，表明中晚期卵巢癌中T 細胞活性功能顯著下降。進一步分析結果提示局部組織中CD8+的分布與數量可能受TIDC 的調節。

綜上所述，卵巢上皮性癌組織中VEGF、COX?2、CD8+、CD4+均存在異常表達，且VEGF、COX?2、CD8+水平可影響卵巢上皮性癌中TIDC 的密度，可能影響宿主的抗腫瘤免疫能力與腫瘤的浸潤轉移。