南京市1例暴露感染HIV病例的溯源調查

董瀟瀟 許文炯 喬夢凱 毛子晴 張洪英 王燕 吳詠梅

作者單位：南京市疾病預防控制中心，江蘇，南京210003

艾滋?。ˋcquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的職業暴露是指工作人員在從事相關工作時被艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染者/AIDS 病人（HIV/AIDS）的血液、體液污染了皮膚、粘膜，又或被含有HIV 的血液、體液污染的針頭等利器刺破皮膚，有被HIV 感染的風險［1］。AIDS 職業暴露涉及到醫療衛生人員和人民警察，其中以醫療衛生人員為主［2?3］。傳統的職業暴露后感染的認定主要依賴于隨訪期內暴露者HIV抗體是否發生陽轉，而在某些特殊情況下，比如暴露者在暴露前、后6 個月內發生過易感染HIV 的行為，或是在暴露時未按照職業暴露處置管理的感染的溯源認定，則需要依賴分子流行病學檢測技術。本市一例醫務人員曾被某HIV 感染者氣道分泌物污染了皮膚，暴露者在暴露后22 天檢測其HIV 抗體為陽性，懷疑其為職業暴露后感染。本調查對其進行了分子流行病學溯源檢測，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象及流行病學資料

醫務人員（以下簡稱H），男，29 歲，曾在處置急診病人（暴露源病人，以下簡稱S）時被其氣道分泌物噴濺至手前臂，污染部位皮膚無破損，并立即以清水沖洗污染的皮膚。當時未按照職業暴露流程處置上報，不曾留取本底血清，也不曾服用藥物進行暴露后預防。隨后S 的入院檢查結果顯示HIV 抗體初篩陽性。暴露發生后的第22 天H 體檢顯示HIV 抗體篩查陽性，H 否認其他可能感染HIV 的高危行為，認為暴露后感染的可能性最大。本研究經倫理委員會批準同意。

1.2 研究方法

1.2.1 采樣及血清學檢測

暴露后第22 天用EDTA 抗凝管采集H 和S全血6 mL，立即顛倒混勻，3 000 r/min 離心15 min 后分離血漿留存。參照《全國艾滋病檢測技術規范（2020 修訂版）》［4］，首先進行HIV 抗體篩查實驗，試劑為Bio?Rad 人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒第四代（酶聯免疫法，批號：0A0488）和Alere 人類免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗體檢測試劑盒（膠體硒法，批號：98806K100A）；初篩陽性樣本進行補充實驗，試劑為MP 人類免疫缺陷病毒（HIV1+2）型抗體檢測試劑盒（免疫印跡法，批號：AE9029）。

1.2.2 核酸提取及目的片段擴增

取200 μL 血漿，提取血漿中病毒RNA，使用醫脈賽全自動核酸提取儀（EmagPure?96Plus）及配套試劑，提取方法參照試劑說明書。提取的RNA通過逆轉錄PCR 及巢式PCR 的方法擴增目的片段。目的片段包括HIV?1 聚合酶pol區、衣殼蛋白gag區及包膜蛋白env區基因片段。擴增試劑由大連寶生物工程有限公司生產，擴增引物見表1。

表1 HIV?1 PCR 擴增引物Table 1 HIV?1 PCR primers

1.3 測序及序列分析

目的產物經電泳鑒定無誤后，擴增成功的HIV?1 pol 區、gag 區和env 區產物送至上海生工生物工程股份有限公司公司純化并測序。反饋的基因序列使用Contig Express 校正和拼接，在美國洛斯阿拉莫斯國家實驗室HIV 核酸序列數據庫（http：//www.hiv.lanl.gov）中比對，判斷基因亞型。利用Mega 軟件的Neighbor Joining 法針對不同目的基因將待溯源樣本及其相似序列同各自參考序列分別構建系統進化樹，同時計算基因距離，其中pol 區加入5 個已知亞型的南京本土HIV 感染病例的序列作為對照。

1.4 統計學方法

將基因距離錄入Excel 表，使用SPSS 20.0 軟件進行數據分析；進行成對樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清學檢測結果

H和S血清學結果均為HIV抗體陽性；兩者補充實驗條帶基本一致，S比H多一條p39條帶。見表2。

表2 血清學檢測結果Table 2 Serological test results

2.2 基因亞型及距離

H 和S 兩份樣本均成功擴增了HIV?1pol區、gag區和env區三個目的片段；三個區的基因亞型檢測結果，H 均為CRF01?AE 型，S 均為CRF07?BC亞型；pol 區、gag 區和env 區序列H 與S 的基因距離分別為0.135、0.187、0.319，均大于H 與其對應相似株的基因距離，也大于S 與其對應相似株的基因距離。見表3。

表3 基因亞型及基因距離Table 3 Gene subtype and gene distance

2.3 系統進化樹構建

HIV?1 pol 區序列系統進化樹如圖1 所示，樣本H 與CRF01?AE 參考亞型聚為一簇，判斷H 為CRF01?AE 亞型，而S 判為CRF?07BC 群。HIV?1 gag 區序列系統進化樹見圖2，H 與CRF01AE 亞型參考序列聚在一起，而S 與CRF07BC 亞型參考序列聚成一簇。HIV?1 env 區系統進化樹如圖3，H 判定為CRF01AE 亞型，而S 與CRF07?BC、CRF08?BC 兩種亞型參考序列聚在一起，認定其為BC 重組亞型。

圖1 溯源樣本HIV?1 pol 區序列系統進化樹Figure 1 Phylogenetic tree of HIV?1 pol region in traceable samples

圖2 溯源樣本HIV?1 gag 區序列系統進化樹Figure 2 Phylogenetic tree of HIV?1 gag region in traceable samples

圖3 溯源樣本HIV?1 env 區序列系統進化樹Figure 3 Phylogenetic tree of HIV?1 env region in traceable samples

3 討論

HIV 感染的溯源調查可以有效地確定傳染源，推測傳播途徑甚至明確傳播方向。以往的溯源多依賴于流行病學調查與追蹤［5］，而且流行病學調查對信息的準確性和詳細度要求更高，也需要專業的訪談技巧。一旦出現被調查對象的不配合，線索有誤或中斷的情況，會影響調查結果，進而影響溯源的可靠性［6?7］。

HIV 分子溯源技術是利用分子生物學技術對有疑似傳播關系的感染者體內的HIV 病毒進行同源性分析。HIV 病毒基因組為兩條單正鏈RNA，每條約9.7 kb。本次溯源調查分別擴增了其中三個基因片段，包括編碼聚合酶前體蛋白的pol區，以及編碼衣殼蛋白和包膜蛋白gag區和env區。Pol區基因相對保守，通常用于分子流行病學的基因亞型檢測［8?9］，gag區和env區變異速度更快，在溯源性分析中應用更多，尤其是包含高變異V3 環區的env基因區［10?12］。本次調查結果三個區的基因亞型結果互相符合，且不論是樣本H 或S 與各自相似株的基因距離還是H 與S 的基因距離，均為pol

本調查采用的PCR 產物Sanger 測序的方法，是將巢式PCR 擴增產物純化后直接測序，流程相對簡單，是HIV 分子溯源技術中最基礎的方法。在本研究結果從分子生物學角度，認為兩者不存在傳播關系。直接測序法對于傳染源的確定具有很大的價值。然而判斷已知傳播關系的傳播方向或是獲得感染者體內更多準種的信息，則需要進一步用到高通量測序的方法［14］。

在職業暴露的溯源鑒定中，擁有先進的檢測手段可以提供客觀而真實的實驗室證據，但職業暴露的規范化管理也顯得尤為重要。首先要不斷強化醫務人員的生物安全意識，定期宣傳培訓，日常工作應當嚴格遵守操作規程，采用合適的防護。尤其是在接觸高危人群/樣本，或是從事風險較高的操作時要提高警惕，萬不可有僥幸心理。醫療機構應當有詳細的職業暴露應急預案及處置流程，處理傷口的同時，也要及時登記上報評估，并做好追蹤工作［15］。該案例也提示，科學嚴謹的預防處置工作不僅可以提高職業暴露的溯源鑒定的效率，也可以降低暴露后感染HIV 的風險。