Galectin?9、NOX?1 mRNA在膽囊癌中表達變化及與癌細胞生物學行為指標的關系

彭正 陳之強 楊琦

作者單位：北京市順義區醫院普外一科，北京101300

膽囊癌是臨床常見消化道系統惡性腫瘤，早期缺乏特異性臨床表現，惡性程度高，具有早期診斷困難、根治性手術切除率低、預后較差等特點，據統計，其5年生存率不足5%［1］。研究表明，癌細胞侵襲性強、轉移速度快是膽囊癌預后差、生存期短的主要因素［2］。膽囊癌發病機制較為復雜，目前臨床普遍認為其發生發展過程涉及多種蛋白、基因，篩選出可靠標志物對早期診斷及預后改善具有重要意義。半乳糖凝集素9（Galactose lectin 9，Galectin?9）是一種抑癌基因，既往臨床已發現其在胃癌、宮頸癌、食管鱗癌中均呈低表達，與病理進展密切相關［3］。NADPH 氧化酶1（NADPH oxidase 1，NOX1）是細胞內重要的氧化酶之一，在多種腫瘤發生與轉移中發揮關鍵作用［4］。但關于兩者在膽囊癌中的作用仍缺乏驗證。為此，本研究分析Galectin?9、NOX?1 mRNA 在膽囊癌中表達變化及與癌細胞生物學行為指標的關系，旨在為臨床提供數據支持。報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取本院2016年5月至2020年8月膽囊癌患者84 例作為研究對象，其中男40 例，女44 例，平均年齡（63.59±6.02）歲，腫瘤大?。浩骄?.63±1.14）cm，臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期30 例，Ⅲ～Ⅳ期54 例，腫瘤浸潤深度：Tis～T238 例，Ti3～T446 例，分化程度：高分化29 例，中分化23 例，低分化32 例，淋巴結轉移40 例。選取距離癌組織邊緣5 cm 左右的組織為癌旁正常組織。納入標準：均經超聲檢查、病理檢查證實為膽囊癌；手術切除前均未接受放化療，預計生存期>6 個月。排除標準：合并其他惡性腫瘤者；存在膽道系統良性腫瘤者；伴有心肝腎等重要臟器嚴重功能異常者；臨床資料缺失者。

1.2 方法

取膽囊癌患者手術切除的癌組織及距離癌組織邊緣5 cm 左右的癌旁正常組織標本，采用Trizol法提取總RNA，于紫外分光光度計上定量分析RNA 純度及濃度。采用日本TaKaRa 公司反轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser）將1 μg 總RNA 逆轉錄為cDNA，引物序列由上海杰李生物公司合成，反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72℃2 min，40個循環，72℃延伸10 min，以2?△△CT值表示Galectin?9mRNA、NOX?1mRNA、癌細胞生物學行為指標［磷酸化信號轉導與轉錄激活因子3（Phosphoryla?tion signal transduction and transcription activator 3，p?STAT3）、凋亡抑制基因Bcl?2、基質金屬蛋白酶7（Matrix metalloproteinase 7，MMP?7）mRNA 相對表達量。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 22.0 處理數據，計量資料以（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較采用LSD?t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；相關性分析采用Spear?man/Pearson 相關系數模型。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織與癌旁正常組織中Galectin?9、NOX?1 mRNA 相對表達量

癌組織中Galectin?9mRNA 相對表達量低于癌旁正常組織，NOX?1mRNA 相對表達量高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 癌組織與癌旁正常組織中Galectin?9、NOX?1 mRNA 相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of Galectin?9 and NOX?1 mRNA expression between cancer tissues and adjacent normal tissues（±s）

表1 癌組織與癌旁正常組織中Galectin?9、NOX?1 mRNA 相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of Galectin?9 and NOX?1 mRNA expression between cancer tissues and adjacent normal tissues（±s）

組別癌組織癌旁正常組織t 值P 值n 84 84 Galectin?9 mRNA 0.20±0.06 0.72±0.20 22.824<0.001 NOX?1 mRNA 2.78±0.41 1.03±0.22 34.471<0.001

2.2 癌組織中Galectin?9 mRNA 與NOX?1 mRNA關聯性

Pearson相關性分析，癌組織中Galectin?9mRNA與NOX?1mRNA呈負相關（r=-0.688，P<0.001）。

2.3 癌組織中Galectin?9、NOX?1 mRNA 與臨床病理特征的關系

Galectin?9mRNA 與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度無關（P>0.05），與臨床分期、淋巴結轉移、分化程度顯著相關（P<0.05）。見表2。

表2 癌組織中Galectin?9、NOX?1 mRNA 與臨床病理特征的關系Table 2 Relationship between Galectin?9、NOX?1 mRNA and clinicopathological features in carcinoma

2.5 癌組織中Galectin?9 mRNA 與癌細胞生物學行為指標相關性

以癌組織中Galectin?9mRNA 平均值為界分為低表達、高表達。Galectin?9mRNA 低表達癌組織中p?STAT3、Bcl?2、MMP?7mRNA 相對表達量高于高表達癌組織（P<0.05）。見表3。Pearson 相關性分析，Galectin?9mRNA 與p?STAT3、Bcl?2、MMP?7mRNA呈負相關（r=-0.619、-0.583、-0.657，P均<0.05）。

表3 癌組織中Galectin?9 mRNA 與癌細胞生物學行為指標相關性Table 3 Correlation between Galectin?9 mRNA and biological behavior of cancer cells

2.6 癌組織中NOX?1 mRNA 與癌細胞生物學行為指標相關性

以癌組織中NOX?1mRNA 平均值為界分為低表達、高表達。NOX?1mRNA 低表達癌組織中p?STAT3、Bcl?2、MMP?7mRNA 相對表達量低于高表達癌組織（P<0.05），見表4。相關性分析，NOX?1mRNA 與p?STAT3、Bcl?2、MMP?7mRNA 呈正相關（r=0.633、0.712、0.604，P均<0.05）。

表4 癌組織中NOX?1 mRNA 與癌細胞生物學行為指標相關性（±s）Table 4 Correlation between NOX?1 mRNA and biological behavior of cancer cells（±s）

表4 癌組織中NOX?1 mRNA 與癌細胞生物學行為指標相關性（±s）Table 4 Correlation between NOX?1 mRNA and biological behavior of cancer cells（±s）

組別低表達癌組織高表達癌組織t 值P 值n 31 53 p?STAT3 mRNA 14.11±2.36 17.18±3.07 4.796<0.001 Bcl?2 mRNA 0.61±0.11 0.88±0.22 6.372<0.001 MMP?7 mRNA 7.29±1.38 9.35±1.12 7.458<0.001

3 討論

膽囊癌在所有膽道系統惡性腫瘤中約占41.30%，由于早期診斷困難，導致多數初診患者已發展至進展期或晚期，其中61.50%～63.80%患者已發生轉移，喪失根治性救治機會，且普遍預后較差［5?6］。因此，尋找分子標志物為臨床早期診斷提供依據、為改善預后創造有利條件成為臨床重要課題。

Galectin?9 是半乳凝集素家族中重要成員之一，既往研究表明，Galectin?9 可通過調控細胞功能參與炎癥、免疫、腫瘤等疾病發生發展過程［7］。Enninga EA 等［8］報道中顯示，Galectin?9 低表達能夠加快黑色素瘤細胞增殖、遷移、侵襲，過表達能夠加快黑色素細胞瘤細胞凋亡。本研究結果說明其可能通過下調表達促進膽囊癌發生，并加快病理改變及病情進展。結合陶楨等［9］研究考慮原因主要在于Galectin?9 具有抑制腫瘤作用，可通過特異性結合細胞表面、細胞間質中的半乳糖，傳遞細胞間、細胞與間質間的信號，從而對細胞黏附、聚集、分化、增殖、凋亡產生調控作用。當其低表達時，無法滿足自身對腫瘤的抑制作用，導致腫瘤細胞加快增殖、分化，促進病理改變，不斷加重病情程度［10］。本研究還顯示，Galectin?9與p?STAT3、Bcl?2、MMP?7 mRNA呈負相關，可能是由于Galectin?9 抑癌作用與p?STAT3、Bcl?2、MMP?7促癌作用形成反向機制而致。由上述結果可知，以Galectin?9 為靶點，提高其在膽囊癌組織中的表達，可能會顯著抑制膽囊癌淋巴結轉移及組織分化，為臨床改善預后提供新思路。

大量臨床實踐證實，氧化應激在腫瘤發生發展中具有重要作用［11?12］。NOX1 是誘導氧化應激反應的關鍵酶之一，能夠增加細胞內活性氧（ROS）水平，參與腫瘤細胞外基質重構及細胞遷移、增殖等病理生理過程［13］。Yamamoto T 等［14］報道中顯示，NOX1過表達會促使胃癌腫瘤細胞出現氧化應激反應，從而促使細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）含量增加，促進胃癌細胞增殖。本研究結果表明NOX1 可通過上調表達促進膽囊癌發生，并對病理改變產生加速作用。推測NOX1 過表達在膽囊癌中的作用機制為：NOX1上調后誘導膽囊癌組織內腫瘤細胞產生氧化應激反應，從而異常氧化蛋白質，使其喪失生物活性，并損傷DNA 雙聯鏈，引發DNA 雙鏈畸變及堿基突變，進而激活原癌基因、抑制抑癌基因活性，導致正常細胞發生癌變；還可經由刺激腫瘤細胞增殖相關基因突變等途徑加快腫瘤細胞變異，增強其惡性程度。p?STAT3、Bcl?2、MMP?7 是膽囊癌傳統腫瘤增殖、侵襲基因，在膽囊癌發生發展中發揮重要作用［15?16］。本研究結果提示NOX?1 能與p?STAT3、Bcl?2、MMP?7等多項傳統腫瘤增殖、侵襲基因發揮共同作用，促進膽囊癌病情進展。故臨床可通過檢測膽囊癌組織中NOX?1mRNA 相對表達量為評估病情、制定針對性抗腫瘤方案提供相關參考依據。

此外，本研究結果還顯示，膽囊癌組織中Galectin?9mRNA 與NOX?1mRNA 具有負相關關系，可見兩者在膽囊癌發生進展過程中聯系緊密，聯合檢測能為臨床提供更為可靠、全面的診治依據，為后續治療創造良好基礎。本研究不足之處在于：作為小樣本研究，可能造成數據偏移，需進一步采取多中心、大樣本分析。

綜上可知，Galectin?9mRNA 下調、NOX?1mRNA 上調可能是膽囊癌發生的重要機制，且兩者表達水平與臨床病理特征、癌細胞生物學行為指標密切相關，為臨床診治提供有效信息。