刃天青顯色法影響因素考察及相關改良方法

江 丹

(1.廣州立白企業集團有限公司，廣東廣州，510370；2.廣東省日用化學品可再生資源研究與應用企業重點實驗室，廣東廣州，510170)

在新型冠狀病毒引發的全球疫情形勢下，家養寵物是否會感染病毒，是否會成為病毒的中間宿主，寵物的衛生安全引發了輿論和民眾的廣泛關注。世界衛生組織已經給出權威解答：目前沒有證據顯示犬貓等寵物會感染新型冠狀病毒[1]。但是，做好寵物居住環境和寵物用品的清潔消毒工作仍然十分必要。在新冠疫情形勢下，具有消毒除菌功效的寵物清潔護理產品是家養寵物消費者十分看重的價值點。然而，如何讓家養寵物消費者在選購消毒除菌寵物清潔產品時切實地感受到除菌功效是業界的痛點。目前的現狀是，消毒除菌寵物清潔產品提供專業檢測機構的功效檢測報告，家養寵物消費者很難獲得直觀的使用感受，特別是在“直播經濟”浪潮下，如何在直播中直觀展示寵物消毒產品的抗抑菌功效，成為了消費者和業界的迫切需要。因此，本研究旨在開發一種可視化的、定性的抗抑菌效果評價方法。

刃天青是一種傳統的氧化還原染料，常用于微生物的生存和增殖情況評估?；罴毎拇x反應將藍色、弱熒光的刃天青還原為粉紅色、強熒光的試鹵靈，說明細菌生長增殖。如果還原反應進一步發生，試鹵靈將繼續被還原成無色的、無熒光的二氫試鹵靈[2]。刃天青被還原的化學變化及顏色變化見表1。因此，可通過檢測刃天青的還原物質試鹵靈和二氫試鹵靈的熒光強度來反應細菌數量[3]。目前已有研究通過刃天青顏色變化進行細菌的半定量分析，如肉類變質檢測[4]、口腔中變形鏈球菌的數量檢測[5]等。

表1 刃天青的化學變化及其相關的顏色變化

實驗考察了細菌培養方式、稀釋液、細菌濃度等因素對刃天青顯色法的影響，以期建立一種快速、可靠、可視化的評價產品抗菌除菌功效的方法，以適用于消毒除菌寵物清潔產品的直播功效展示。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實驗菌種

金黃色葡萄球菌ATCC6538，購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑與儀器

市售寵物消毒液，可用于寵物生活環境及用品的消毒除菌。

刃天青（購自阿拉?。?；氯化鈉（購自天津市大茂化學試劑廠，分析純）；葡萄糖（購自廣東光華科技股份有限公司，分析純）；蛋白胨（購自OXOID）；營養瓊脂培養基（購自廣東環凱微生物科技公司）；D/E中和肉湯（購自DB公司）。

0.1 %刃天青溶液：取刃天青0.1 g，加蒸餾水100 mL，121℃滅菌20 min，避光保藏不超過1周。

生理鹽水：取氯化鈉8.5 g，加蒸餾水1000 mL，待完全溶解后，調pH至7.2～7.4，經121℃壓力蒸汽滅菌20 min后備用。

PBS（0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液）：稱取無水磷酸氫二鈉2.83 g，磷酸二氫鉀1.36 g，加蒸餾水1000 mL，待完全溶解后，調pH至7.2～7.4，經121℃壓力蒸汽滅菌20 min后備用。

儀器均為微生物實驗室常用儀器設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 刃天青顯色反應的影響因素研究（

1）菌種培養方式

分別取36℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌營養瓊脂斜面菌種和營養瓊脂平板菌種，用0.25%葡萄糖溶液洗滌菌種，用濁度儀調節菌懸液至濃度一致，用活菌計數法測定細菌濃度。各取稀釋菌懸液5 mL至無菌試管中，再加入100 μL刃天青溶液，混合均勻后，將試管放置于36℃水浴鍋中并立即計時，觀察刃天青顏色變化。

（2）促進劑

取36℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌營養瓊脂平板菌種，分別用無菌水、生理鹽水、2%蛋白胨溶液和0.25%葡萄糖溶液洗滌菌種平板，5 mL/塊平板，分別將菌懸液調整至濃度約3×108CFU/mL，同時按平板活菌計數法測定菌懸液濃度。

各取稀釋菌懸液5 mL至無菌試管中，加入100 μL刃天青溶液，混合均勻后，將試管放置于36℃水浴鍋中并立即計時，觀察刃天青顏色變化。

（3）細菌濃度

取36℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌營養瓊脂平板菌種，用0.25%葡萄糖溶液洗滌菌種平板，5 mL/塊平板，并稀釋菌懸液至107～109CFU/mL，同時按平板活菌計數法測定菌懸液濃度。

分別取稀釋菌懸液5 mL至無菌試管中，各加入100 μL刃天青溶液，混合均勻后，將試管放置于36℃水浴鍋中并立即計時，觀察刃天青顏色變化。

1.2.2 改良的刃天青顯色法和傳統殺菌測試方法對比

（1）傳統殺菌測試方法

用0.25%葡萄糖溶液將市售寵物消毒液稀釋至1:150和1:400，參考QB/T 2738－2012《日化產品抗菌抑菌效果的評價方法》開展抗菌測試。要求對照菌懸液濃度控制在2×108～9×108CFU/mL；中和劑選用D/E中和肉湯；作用時間為1 min和5 min。殺菌率＞90%表示有殺菌作用。

（2）改良的刃天青顯色法

取3 6℃培養1 8～2 4 h的金黃色葡萄球菌營養瓊脂平板菌種，0.2 5%葡萄糖溶液洗滌菌種平板，5 m L/塊平板，將菌懸液調整至濃度2.0×108～9×108CFU/mL。

用稀釋菌懸液將市售寵物消毒液稀釋至1:150和1:400，取各稀釋液5 mL至無菌試管中，再加入100 μL刃天青溶液，混合均勻后，將試管放置于36℃水浴鍋中并立即計時，觀察刃天青顏色變化。同時取5 mL菌液稀釋液，按上述步驟操作，作為陽性對照，編號為C。

2 結果與討論

2.1 刃天青顯色法的影響因素

2.1.1 培養方式

細菌培養方式的影響見表2。從表2可以看出，在細菌濃度一致的情況下，平板培養的菌懸液使得刃天青顏色變化明顯快于斜面菌種懸液。提高斜面菌種的濃度至平板菌種濃度的3倍，其顏色變化速度也較平板菌種慢5 min以上。想要快速改變刃天青顏色，平板培養菌種的方式優于斜面。

表2 細菌培養方式的影響

2.1.2 促進劑

促進劑的影響見表3。從表3可以看出，2%的蛋白胨和0.25%葡萄糖均可以加速刃天青顏色的變化，有助于在短時間內展示殺菌效果，0.25%葡萄糖的促進效果優于蛋白胨，以蛋白胨作為促進劑的刃天青溶液在10 min時可變為粉紅色，葡萄糖則可在5 min內使得刃天青從藍色變為粉紅色。因此，選用0.25%葡萄糖作為刃天青顯色實驗的促進劑。

表3 促進劑的影響

2.1.3 細菌濃度

細菌濃度的影響見表4。從表4可以看出，隨著細菌濃度的提高，刃天青顏色變化加快，細菌濃度接近時，刃天青顏色變化也較為接近。隨著孵育時間的延長，刃天青也逐漸從藍紫色向粉紅色轉變。在細菌濃度接近的情況下，實驗結果重現性好。因此，觀察刃天青的顏色可以半定量地評估金黃色葡萄球菌的濃度。

表4 細菌濃度的影響

當金黃色葡萄球菌的濃度為7.6×107CFU/mL時，需要9 min才能將刃天青轉變為紅色。為了在5 min內將刃天青的顏色轉變為粉色或紅色，金黃色葡萄球菌的濃度應在1.9×108CFU/mL以上；當濃度在9.1×108CFU/mL及以上時，紅色/粉紅色的試鹵靈會在短時間內進一步還原為無色的二氫試鹵靈。為保障刃天青顏色變化的時間波動較小，細菌濃度調控范圍為2.0×108～9×108CFU/mL。

2.1.4 改良的刃天青顯色法

綜上，刃天青顯色反應受到培養方式、促進劑、細菌濃度等多種因素影響。為使顯色反應發生在5 min之內，改良的刃天青顯色法需具備以下條件：菌種為營養瓊脂平板新鮮培養金黃色葡萄球菌，菌懸液用量為5 mL，0.1%刃天青溶液用量為100 μL，0.25%葡萄糖溶液作為促進劑，菌懸液稀釋液濃度為2.0×108～9×108CFU/mL。

2.2 改良刃天青顯色法和傳統殺菌方法對比

2.2.1 傳統殺菌測試方法

為匹配刃天青顏色變化所需的細菌濃度，殺菌測試中初始加入細菌濃度也需達到108CFU/mL。殺菌作用時間為1 min時，寵物消毒液1:150稀釋液和1:400稀釋液均無殺菌作用，作用時間延長至5 min時，1:150稀釋液有殺菌作用（見表5）。

表5 傳統殺菌測試結果

2.2.2 改良刃天青顯色方法的測試結果

從圖1可以看出，稀釋150倍的寵物消毒液，孵育5 min顏色沒有變化，孵育18 h后，顏色略有變化，刃天青呈現藍紫色；而稀釋400倍的寵物消毒液，孵育4 min后，刃天青的顏色已經從藍色變為紫紅色，到第5 min時呈明顯的粉紅色。而陽性對照從4 min到5 min時，已經從粉紅色轉變為接近無色。從孵育5 min至18 h，稀釋400倍的寵物消毒液和陽性對照顏色均沒有明顯變化。說明孵育5 min足以展現寵物消毒液的殺菌效果。

圖1 刃天青顯色法的測試結果

因此，稀釋150倍的寵物消毒液具有殺菌作用，稀釋400倍的寵物消毒液無殺菌作用。這與表4測試結果一致。由此說明，刃天青顏色變化法可用于寵物消毒液殺菌效果演示。改良的顯色反應的結果和傳統殺菌測試方法的結果一致。上述顯色反應耗時較短，在5 min之內。而且結果可靠，適合用于即時殺菌效果評估?？梢詰糜谙境a品的直播功效展示。

3 結論

通過對刃天青顏色變化影響因素的研究，發現金黃色葡萄球菌作為測試菌種時，菌種培養方式、促進劑及菌懸液的濃度均對刃天青顯色反應有明顯的影響。改良的刃天青顯色法包含以下的條件：選擇用營養瓊脂平板培養菌種，稀釋液為0.25%葡萄糖溶液，控制細菌濃度在2.0×108～9×108CFU/mL，該法可在5 min內定性評價寵物消毒液的殺菌效果。