熒光聚多巴胺-金量子點應用于癌細胞的高效成像檢測

周瑜 譚虹 鄧謙亦 左芳

摘? 要：為了準確識別癌細胞，制備了一種具有熒光性能的聚多巴胺-金量子點.該量子點納米材料是基于前人方法，在室溫下以多巴胺為唯一前體控制合成來制備小尺寸聚多巴胺，然后在高溫、過氧化氫存在的條件下利用產生的羥基自由基去破壞聚多巴胺的π-π結構來生成具有熒光性能的聚多巴胺量子點，并在其表面通過還原氯金酸形成聚多巴胺-金量子點;利用熒光成像技術，通過觀察聚多巴胺-金量子點的熒光淬滅情況來實現對癌細胞中谷胱甘肽（GSH）的檢測.結果表明，該量子點納米材料可以實現對癌細胞的特異性熒光成像檢測，為開發高效的識別生物傳感器和對癌細胞的精準識別提供了一種有效的策略.

關鍵詞：癌細胞;聚多巴胺-金;谷胱甘肽;熒光成像;納米材料

中圖分類號：TB383;O657.3? ? ? ? ? ? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.03.017

0? ? 引言

癌癥是人類最致命的疾病之一[1].中國每年新增癌癥病例約439萬例，死亡病例281萬例[2].癌癥治療很復雜，生物醫學領域的進步將癌癥診斷研究帶入了一個新的領域[3].熒光成像作為一種新的成像技術，因其較高的時空分辨率在生物醫學研究中得到了廣泛的應用[4-5].熒光成像時常用有機染料和無機納米粒子（金屬量子點）來識別癌細胞[6-7].然而，由于光穩定性差、水溶性低、毒性大、生物相容性差等原因，將各種有機染料和金屬量子點作為熒光探針應用于熒光成像受到了限制.由于聚合物熒光納米顆粒（PFNPs）具備優異的光學性能，毒性小，成本低，在藥物傳遞、化學傳感器、生物成像和生物分析等領域引起了人們極大的興趣，被認為是生物醫學應用的理想選擇[8-9].盡管一些PFNPs具有良好的水溶性，但大多數PFNPs的水穩定性較差，需要對其進行復雜的功能修飾才能進一步應用于生物分析和生物成像[10].因此，開發水溶性理想、穩定性高、制備簡單的熒光高分子材料具有重要意義.

與有機染料和金屬量子點相比，10～20 nm的小尺寸熒光聚多巴胺量子點（PDs）具有獨特的物理化學性質和良好的生物相容性，近年來得到了廣泛的研究[11].它們不會對標記的生物分子的固有行為造成很大的損害，可以更好地穿透和分布在細胞間隙[12].然而，這些熒光納米顆粒往往無法對癌細胞進行特異性熒光成像，因此，研制出具有特異性細胞成像功能且制備簡單的熒光PDs具有重要意義.

由于癌細胞中谷胱甘肽（GSH）的濃度? ? ? ? ? ? （2～10 mmol/L）高于正常細胞，所以高濃度的GSH可以成為癌細胞的特異性標志物[13].依據文獻[14]， GSH具有熒光淬滅作用，基于此，本文研究了一種在室溫下一步氧化前體多巴胺（DA）合成熒光聚多巴胺-金量子點（PDs-g）的簡便方法，并進一步驗證了其在高靈敏度和選擇性識別癌細胞中高表達的GSH方面的應用.同時，證明了此優化策略合成PDs-g是一種不需要復雜儀器的簡單有效的方法，而且所制備的熒光PDs-g能較好地檢測出癌細胞中的GSH，這為今后精準識別癌細胞提供了一種有效的策略.

1? ? 實驗方法

1.1? ?儀器和試劑

主要儀器：JEOL JEM 2010F 場發射透射電鏡，日本JEOL公司; MALVERN ZETASIZER NANO ZS90動態光散射（DLS），英國MALVERN公司;紫外可見分光光度計，上海奧析科學儀器有限公司;SPECTRUM ONE 傅里葉變換紅外光譜儀，美國PE儀器公司;FLUOROLOG-3型熒光分光光度計，法國HORIBA JOBINYVON公司;倒置熒光顯微鏡（FM）（蔡司德國）;原子力顯微鏡（AFM），日本日立公司.

主要試劑：鹽酸多巴胺（DA）、氫氧化鈉、四氯金酸水合物和氫硼酸鈉均購于探索平臺（上海）;谷胱甘肽購自南京化學試劑有限公司.

1.2? ?小尺寸聚多巴胺納米粒子（PDA）的合成

PDA根據文獻[15]制備，方法略有變化.首先，將鹽酸多巴胺、NaOH溶液（20 mmol/L，50 mL）溶解于去離子水中，50 ℃加熱攪拌5 h.最后，將產品離心洗滌3遍，保存在黑暗的地方.

1.3? ?熒光聚多巴胺量子點（PDs）的制備

依據文獻[16]，將1.2所得產物添加到含有H2O2（20%，15 mL）和NaOH（2.5 mol/L，10 mL）的溶液（pH 10）中.將所得溶液（pH 10.4）加熱回流? ? ?5 h，可觀察到顏色由黑色變為黃色.反應混合物冷卻至室溫，然后用10%乙醇透析24 h（分子量為? ? 1 kDa）.純化產物的溶液（pH 7.4）保存在4 ℃條? ? ? 件下.

1.4? ?熒光聚多巴胺-金量子點（PDs-g）的制備

將1.3所得產物加入含有氯金酸的溶液中，并緩慢逐滴加入NaBH4（1 mL）溶液.將所得溶液室溫避光攪拌30 min，可觀察到顏色由黃色變為深黃色.反應混合物用去離子水透析24 h（分子量為? ? ? 1 kDa）.純化產物的溶液（pH 7.4）避光保存在4 ℃條件下.

1.5? ?聚多巴胺-金量子點（PDs-g）的熒光檢測

在該體系實驗中，將PDs-g（1 mg/mL）納米顆粒添加到 Tris?HCl 緩沖液中，該溶液在旋渦混合器上混合3 min，最終通過熒光分光光度計檢測其熒光光譜.

1.6? ?谷胱甘肽對聚多巴胺-金量子點（PDs-g）的熒光淬滅

首先將小鼠乳腺癌細胞（4T1）接種在直徑為? ?20 mm的玻璃底培養皿上貼壁培養.24 h后，分別將PDs和PDs-g加至不同的培養皿中，根據實驗要求繼續孵育相應的時間，并設置空白對照組.然后用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗培養皿3次，置于熒光顯微鏡下進行細胞熒光成像觀察.

2? ?結果和討論

2.1? ?聚多巴胺-金量子點（PDs-g）的表征與性能

聚多巴胺-金量子點的制備流程如圖1所示.首先以DA為原料在氫氧化鈉溶液中加熱攪拌反應，制備小尺寸聚多巴胺納米粒子（PDA），隨后將PDA加入含有過氧化氫（H2O2）溶液中加熱回流反應5 h，得到小尺寸具有熒光的聚多巴胺量子點納米粒子（PDs），最后加入氯金酸（HAuCl4），通過逐滴加入硼氫化鈉（NaBH4）得到熒光聚多巴胺-金量子點納米粒子（PDs-g）.通過透射電子顯微鏡（TEM）表征PDA、PDs和PDs-g的形貌和大小，結果如? 圖2—圖3所示.圖2（a）為PDA的TEM圖像和粒徑（DLS）圖，圖中顯示PDA的形貌分布較為均一，且粒徑分布相對較窄，粒徑約為40 nm.圖2（b）則展示了PDs的TEM圖像，可在圖中看到一顆顆均勻分布的球狀納米顆粒，且平均直徑約為（12[±]3）nm的PDs.通過原子力顯微鏡（AFM）和典型截面對PDs進行了分析，如圖2（c）—圖2（d）所示，結果表明，PDs呈球形且高度分布在5～6 nm.

圖3（a）為PDs-g的TEM圖像，由圖3（a）可見，粒子是單分散的，但大小略有不同.高分辨率TEM（HRTEM）圖像（圖3（b））顯示，PDs-g具有清晰的晶格結構，條紋間距為0.36 nm，與文獻[17]一致.通過TEM中的EDS元素映射分析和高角環形暗場成像表征，結果顯示，元素金（Au）均勻地分散在 PDs-g（圖3（c）—圖3（d））.為了進一步確認復合結構的形成，進行了能量色散X射線光譜圖（EDS）表征，其結果如圖3（e）所示.EDS結果表明，PDs-g中檢出了Au元素.

與DA的吸收光譜（圖4（a））相比，由于5，6-二羥基吲哚單元的形成，PDA的紫外光譜圖顯示從200～500 nm具有一個寬吸收峰.PDA在280 nm處的吸收強度相對較低，說明PDA中含有一定比例的多巴胺.PDs的光譜也顯示了從200～500 nm具有一個寬吸收峰，表明PDs應該具有與PDA相同的結構.如圖4（b）所示，利用傅里葉紅外光譜（FTIR）對其進行了表征，紅外吸收峰寬帶（3 343～3 226 cm?1）可能屬于N—H和—OH伸縮振動，2 960 cm?1的結果是C—H伸縮振動模式.1 608 cm?1處的吸收振動峰歸因于—NH2.這些結果表明，PDA和PDs的表面由于自然氧化而含有大量的含氧和氮基團. 基于此，本文研究了DA、PDA和PDs的熒光性質.在360 nm處激發時，只有PDs在450 nm處產生了熒光發射峰（圖4（c））.在相同的激發波長下，聚多巴胺納米粒和DA在450 nm處沒有熒光發射峰（圖4（c））.用不同的激發波長去激發PDs，當激發波長從300 nm增加到500 nm時，最大發射從 447 nm移動到556 nm（圖4（d）），結果表明，PDs的最大發射強度與激發波長密切相關，且在激發波長為? ? ? 360 nm時，具有最高強度的發射波長.

為驗證PDs-g在較為嚴苛的環境中是否仍具有熒光檢測效果，研究了PDs-g在不同鹽濃度中的熒光穩定性情況，結果如圖5（a）所示.由圖5（a）可知，即使在氯化鈉鹽濃度達到500 mmol/L時，PDs-g的熒光強度幾乎沒有減弱.同時，研究了不同pH值條件下對PDs-g的熒光性能的影響情況，結果如圖5（b）所示.從結果可知，PDs-g的熒光強度無論是在酸性條件下，還是在堿性條件下，其熒光強度均未發生改變.以上結果證明了該PDs-g無論是在高濃度鹽條件下，還是酸堿條件下，都具有較好的熒光穩定性，這為日后的應用奠定了一定的基礎.

2.2? ?熒光聚多巴胺-金量子點對癌細胞熒光成像

利用熒光顯微鏡研究了PDs-g對癌細胞的熒光成像檢測能力.將4T1作為模型細胞，分為3組（空白對照組、PDs組和PDs-g組），熒光圖像如圖6所示.由圖6可見，空白對照組的4T1沒有檢測到任何熒光，而PDs組的4T1則發出明顯的藍色熒光，表明PDs能對癌細胞進行細胞層面的熒光成像.值得注意的是，PDs-g組與4T1孵育12 h后，其熒光幾乎消失不見.這歸因于癌細胞內高濃度過表達的谷胱甘肽（GSH）通過Au—S鍵鍵合在了PDs-g表面，使其熒光發生了淬滅[18].

對PDs-g與4T1進行了不同孵育時間的實驗，如圖7所示.從圖7可以看到，當PDs-g與細胞孵育2 h時，此時的PDs-g應該是剛剛被內吞到4T1中，而癌細胞里的GSH還未鍵合到PDs-g表面上，因此，可以看到其發出的強烈藍色熒光.而當PDs-g與癌細胞孵育8 h后，其藍色熒光幾乎消失了.這表明癌細胞中高濃度的GSH已經鍵合到其表面了，使PDs-g的熒光發生了淬滅.以上結果表明，通過監測PDs-g在癌細胞中的熒光變化情況可以實現對癌細胞的特異性熒光成像檢測.

3? ? 結論

本文基于前人的方法合成出小尺寸的聚多巴胺納米粒子之后，在高溫和過氧化氫存在的條件下，利用產生的羥基自由基去破壞聚多巴胺的π-π結構來生成具有熒光性能的聚多巴胺量子點，并通過在其表面還原氯金酸制備出了具有熒光性能的聚多巴胺-金量子點.同時，利用透射電鏡、粒徑、熒光光譜等表征手段對制備的聚多巴胺-金量子點進行了一系列表征，并利用熒光成像方法，將聚多巴胺-金量子點與癌細胞共孵育后，觀察到癌細胞能有效地淬滅聚多巴胺-金量子點的熒光，該結果表明聚多巴胺-金量子點能夠精準地識別出癌細胞.

參考文獻

[1]? ? ?MAO Y Q，LIU X Y. Bioresponsive nanomedicine：the next step of deadliest cancers' theranostics[J].Frontiers in Chemistry， 2020，8：257.

[2]? ? ?劉宗超，李哲軒，張陽，等.2020全球癌癥統計報告解讀[J]. 腫瘤綜合治療電子雜志，2021，7（2）：1-13.

[3]? ? ?CHATURVEDI V K，SINGH A，SINGH V K，et al. Cancer nanotechnology：a new revolution for cancer diagnosis and therapy[J].Current Drug Metabolism，2019，20（6）：416-429.

[4]? ? ?JI Y Y，JONES C，BAEK Y，et al. Near-infrared fluorescence imaging in immunotherapy[J].Advanced Drug Delivery Reviews， 2020，167：121-134.

[5]? ? ?DAI X H，HAN Z W，FAN H，et al. Sulfur doped carbon nitride quantum dots with efficient fluorescent property and their application for bioimaging[J].Journal of Nanoparticle Research，2018，20（12）：315.

[6]? ? ?SETSUKO T，TAKASHI J. Shortwave-infrared （SWIR）fluorescence molecular imaging using indocyanine green-antibody conjugates for the optical diagnostics of cancerous tumours[J].RSC Advances，2020，10（47）：28171-28179.

[7]? ? ?XU Z Y，HU L，YUAN J，et al. A fluorescence probe for metal ions based on black phosphorus quantum dots[J].Advanced Materials Interfaces，2020，7（7）：1-9.DOI：10.1002/admi.201902075.

[8]? ? ?ZHAO P，WU Y S，FENG C Y. et al.Conjugated polymer nanoparticles based fluorescent electronic nose for the identification of volatile compounds[J].Analytical Chemistry，2018，90（7）：4815-4822.

[9]? ? ?SUN J Y，MEI H，WANG S F，et al. Two-photon semiconducting polymer dots with dual-emission for ratiometric fluorescent sensing and bioimaging of tyrosinase activity[J].Analytical Chemistry，2016，88（14）：7372-7377.

[10]? ?CUI Q L，XU J S，SHEN G Z，et al. Hybridizing carbon nitride colloids with a shell of water-soluble conjugated polymers for tunable full-color emission and synergistic cell imaging[J].ACS Applied Materials and Interfaces，2017，9（50）：43966-43974.

[11]? ?TIAN J X，FANG Y Z，YU R，et al. A redox modulated fluorescence nanoplatform for the detection of alkaline phosphatase activity with fluorescent polydopamine nanoparticles[J].Analytical Methods，2020，13（3）：322-326.

[12]? ?YU J B，WU C F，ZHANG X J，et al. Stable functionalization of small semiconducting polymer dots via covalent cross-linking and their application for specific cellular imaging[J].Advanced Materials，2012，24（26）：3498-3504.

[13]? ?張鈺，尹少平，徐佳楠，等.腫瘤微環境刺激響應聚合物納米遞藥系統的研究進展[J].藥學進展，2018，42（5）：366-374.

[14]? ?XIN Y W，DANIEL Q G，SIVAKUMAR M，et al. Integrating gold nanoclusters，folic acid and reduced graphene oxide for nanosensing of glutathione based on "turn-off" fluorescence[J].Scientifc Reports，2021，11（1）：2375.

[15]? ?ZHANG X Y，WANG S Q，XU L X，et al.Biocompatible polydopamine fluorescent organic nanoparticles：facile preparation and cell imaging[J].Nanoscale，2012，4（18）：5581-5584.

[16]? ?LIN J H，YU C J，YANG Y C，et al. Formation of fluorescent polydopamine dots from hydroxyl radical-induced degradation of polydopamine nanoparticles[J].Physical Chemistry Chemical Physics，2015，17（23）：15124-15130.

[17]? ?FAN H L，YU X，LIU Y，et al. Folic acid-polydopamine nanofibers show enhanced ordered-stacking via π-π interactions[J]. Soft Matter，2015，11（23）：4621-4629.

[18]? ?LI X，WANG H Y，ZHANG Y H，et al. A GSH-? ? ? ?responsive PET-based fluorescent probe for cancer cells imaging[J].Chinese Chemical Letters，2021，32（4）：1541-1544.

High efficiency imaging detection of cancer cells by fluorescent

polydopamine-gold dots

ZHOU Yua， TAN Honga， DENG Qianyia， ZUO Fangb

（a. Institute of Qinghai-Tibet Plateau; b. School of Chemistry & Environment， Southwest Minzu University， Chengdu 610041， China ）

Abstract： A kind of fluorescent polydopamine-glod dots were prepared to identify cancer cells accurately. Based on the previous method， small size polydopamine was synthesized at room temperature with? ? dopamine as the only precursor， then， the hydroxyl radical was used to destroy the π-π structure of? polydopamine at high temperature in the presence of hydrogen peroxide， which can be used to generate polydopamine dots with fluorescence properties. Finally， chloroauric acid was reduced on its surface to form polydopamine-glod dots. Glutathione （GSH） in cancer cells was detected by fluorescence imaging by observing the fluorescence quenching of polydopamine-gold quantum dots. The results show that the quantum dot nanomaterials can realize the specific fluorescence imaging detection of cancer cells， which provides an effective strategy for developing efficient recognition biosensors for cancer cells and identifying cancer cells accurately.

Key words： cancer cells; polydopamine-glod; glutathione; fluorescence imaging; nano materials

（責任編輯：黎? ?婭）