TRIF-NF-κB 信號通路參與TLR3 介導的胰島β 細胞損傷

朱祎婧，艾智華，鐘大鵬

糖尿病的主要特征是體內的糖脂代謝發生紊亂，伴隨著血葡萄糖的升高[1]。作為分泌胰島素的重要來源，胰島β 細胞在能量代謝平衡及糖尿病的發生、發展過程中扮演了重要角色[2]。近年來，針對糖尿病患者以及糖尿病動物模型的研究提示：胰島β細胞損害及功能障礙，可能與體內過多營養物質的代謝產物所引發的慢性非特異炎癥的持續有關[3-5]。Toll 樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）可誘導多種炎癥因子的釋放，進而發揮免疫作用[6]。前期研究發現高糖高脂可抑制胰島β 細胞的增殖,同時上調了TLR3、TNF-α、IL-1β 等炎癥因子的表達，這表明TLR3 介導的炎癥反應參與了高脂、高糖誘導的胰島β 細胞的損傷[7]。予以TLR3 特異性激動劑聚肌胞（PIC）刺激可明顯抑制胰島β 細胞分泌胰島素的功能，且炎性因子表達明顯升高[8]。上述研究結果表明，激活胰島β 細胞TLR3 會抑制其增殖和功能，潛在的機制可能與TLR3 激活誘導TNF-α，促進炎癥因子的合成與釋放有關[8]。但TLR3 受體激活誘導的炎癥反應具體是如何影響胰島β 細胞尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與實驗分組 選用含雙抗（100 U/ml青霉素和100 mg/ml 鏈霉素）的DMEM 培養基（SH30243.01B，Hyclone 公司）培養小鼠胰島β 細胞株（NIT-1，武漢普賽諾生命科技有限公司），觀察細胞狀態進行細胞傳代。將細胞接種于96 孔板(每孔約7×103個的細胞)后改用含10% 胎牛血清的培養基培養24 h 后，換用含0.1% 胎牛血清的DMEM培養基予細胞同步化處理。所有細胞經同步化處理24 h 后觀察細胞生長狀況，待細胞貼壁后予以PIC（10108812001，Sigma）刺激48 h。實驗分4 組：Blank 組、30 μg/ml PIC 組、60 μg/ml PIC 組、90 μg/ml PIC 組。

1.2 流式檢測細胞周期 用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化細胞后用PBS 洗滌。將細胞懸液離心（1000 r/min，5 min）處理（重復兩次），棄上清留取細胞沉淀。將70%乙醇預冷處理，然后緩慢加入用PBS 重懸的細胞沉淀（約5×105～106個細胞），混勻后在4 ℃條件下固定過夜。次日細胞沉淀離心后加入PBS 后再次離心（1500 rr/min，10 min），重復兩次取細胞沉淀，避光環境下向細胞沉淀中加入200 μl 預先配好的DNA 染液（PI solution 20 μg+Triton x-100 1 μl+Rnase A solution 0.2 mg+PBS 定容到1 ml），在室溫下孵育15 min 后流式細胞儀檢測（Cyt-Expert，Beckman 公司）。

1.3 PCR 檢測NF-κB 及TRIF 的mRNA 表達 采用RNA 提取試劑盒（TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit，Cat.# 9767)進行RNA 提取。于冰上配制反應混合液（gDNA Eraser 1 μl,5X gDNA Eraser buffer 2 μl,Total RNA 7 μl），加入RNA 樣品后立即在42 ℃反應2 min，然后置于4 ℃保持。2%瓊脂糖凝膠電泳法對樣品RNA 完整性進行檢測并用DNA/RNA 測定儀測定混合物濃度和純度。根據合成的引物檢測TRIF 及NF-κB 的mRNA 表達量，檢測方法嚴格按照RT-PCR 試劑盒（iQTMSYBRRGreen Supermix kit，Bio-Rad）說明書進行操作。根據Gene-bank 提供的基因序列設計相關引物序列(表1)。

表1 引物序列

1.4 檢 測TRIF、NF-κB、CyclinD1 及Caspase-3 蛋白表達 各組細胞樣本經RIPA 裂解后離心（12000 r/min，10 min）取上清,采用BCA 法測定蛋白濃度。制備分離膠和濃縮膠，待濃縮膠聚合后將待測樣品與等體積蛋白loading 添加至加樣孔，電泳后依次進行轉膜、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、洗滌、發光。一抗抗體稀釋比例信息見表2。

表2 一抗抗體稀釋比例信息

1.5 統計學方法 應用SPSS 13.0 軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多樣本均數間比較采用方差分析（one-way ANOVA），P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞周期檢測 通過流式細胞計數方法檢測細胞增殖的情況（圖1），結果發現與空白對照組相比，隨著PIC 刺激濃度的增加，NIT-1 細胞停留在G0/G1 期細胞的比例明顯上調（P<0.01），而在S 期和G2/M 期的細胞比例出現明顯下調（P<0.01）。

圖1 流式細胞周期統計結果

2.2 TRIF、NF-κB mRNA 表達 與Blank 組比較，胰島β 細胞TRIF 和NF-κB 的mRNA 表達量隨著PIC 刺激濃度的升高而增高（圖2）。在低濃度PIC（30 μg/ml）刺激時，mRNA 表達出現了上調趨勢，但無統計學差異（P>0.05），而在中等濃度和高濃度時mRNA 表達量明顯上調（P<0.01）。

圖2 TRIF 與NF-κB mRNA 表達情況

2.3 蛋白表達 細胞周期蛋白CCND1 表達量（圖3）在不同濃度PIC 刺激下均明顯下調（P<0.01），且與PIC 刺激濃度的升高呈現負相關；pro-CASP3在低濃度和中濃度PIC 刺激時表達量上調程度明顯低于高濃度刺激（P<0.01），而cleaved-CASP3蛋白表達量的升高幅度呈濃度依賴性（P<0.01）；TRIF 蛋白表達在經不同濃度PIC 干預后呈現明顯上調（P<0.01）；NF-κB 蛋白表達也呈現濃度依賴性上升（P<0.01）。

3 討論

盡管引起糖尿病的原因眾多，但似乎都與誘發組織細胞氧化應激的增加，進而引起一系列炎癥因子的激活有關[9]。炎癥因子的激活將導致胰島β 細胞的結構和功能受到損傷、外周組織對胰島素的敏感性降低即胰島素抵抗的形成[10]。團隊前期研究發現予以高脂高糖刺激會明顯抑制NIT1 細胞細胞增殖，同時其分泌胰島素的功能也受到了極大的抑制[7]。本研究證實了PIC 刺激NIT1 細胞株可使大量增殖細胞停留在細胞周期的G0/G1 期，而未能繼續分裂成熟到S/G2 期，且對細胞增殖的抑制作用呈現濃度依賴性。有研究表明，CCND1 的表達對維持胰島β 細胞的數量上發揮了重要作用，過表達CCND1 明顯上調了人胰島β 細胞的增殖[11]。而在此實驗中，NIT1 細胞經PIC 刺激后，CCND1 的表達受到了明顯抑制，且呈現濃度依賴的趨勢，提示PIC 刺激在阻斷胰島β 細胞從G1 期進入S 期的過程中，CCND1 可能是TLR3 信號通路的作用靶點。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡的過程。目前的研究認為Caspase 家族是哺乳動物細胞凋亡過程中的重要分子[12]，其中Caspase 3 被認為是細胞凋亡過程Caspase 級聯反應中最重要的效應型Caspase[13]。本研究予以不同濃度PIC 處理后，凋亡相關蛋白分子Caspase3 的表達出現了明顯改變，提示予以PIC刺激后激活了細胞凋亡的級聯反應，使細胞增殖受抑制以及凋亡增加，這可能是導致胰島β 細胞數量的減少和（或）胰島素分泌不足的原因。

TLR3 參與了機體重要免疫作用，它可識別病毒來源的dsRNA 及其類似物PIC 觸發促炎細胞因子的釋放[14]。對比TLR3 敲除小鼠與野生型小鼠發現，高脂飲食喂養下，TLR3 敲除小鼠的糖耐量和脂質狀況有所改善，還有促炎細胞因子和炎癥趨化因子基因表達的下調，這表明TLR3 可能是糖脂代謝中的重要調節分子[15]。本課題前期研究結果證實，高脂高糖刺激會上調TLR3 的表達，而艾塞那肽可改善糖脂毒性對胰島β 細胞的增殖抑制,下調糖脂毒性誘導的炎癥因子的表達，可能與TLR3 信號通路被抑制有關[16]。在誘導炎癥反應中，TLRS（除TLR3）都可通過髓樣分化反應蛋白88（MyD88）依賴途徑誘導相關炎癥因子的釋放[17]。除了MyD88 依賴信號通路，TLR 還可以與TRIF 相關接頭分子結合以招募TRIF 結合蛋白，TRIF 活化后可激活TANK 結合激酶1，進而再激活干擾素調節因子3，誘導分泌炎性因子IFN-β。與其他TLR 不同的是，TLR3 不依賴MyD88 信號通路，可直接激活TRIF 相關信號通路，介導下游的信號轉導[18]。本次實驗予以TLR3 特異性激動劑PIC 刺激NIT1 細胞后，TLR3 與其下游TRIF 的mRNA 表達逐漸上調，且與刺激的PIC 濃度呈正相關，這表明TLR3-TRIF 信號通路的激活在胰島β 細胞損傷中可能發揮了重要作用。同時，TLR3-TRIF 下游信號通路中NF-κB 也被PIC 活化，且隨PIC 刺激濃度的增加而增加。提示NIT1 細胞增殖受抑制以及凋亡的增加可能與TLR3-TRIFNF-κB 炎癥信號通路的激活，進而抑制胰島β 細胞生長和分化，誘導β 細胞凋亡和功能障礙有關。