以L-亮氨酸為底物一步法生物合成α-酮異己酸

AL-ADEEB Abdulqader,喬郅鈉,徐美娟,楊套偉,張顯,邵明龍,饒志明

(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

α-酮異己酸是亮氨酸的無氮替代物,可作為慢性腎臟疾病和乙型肝炎病毒感染治療的組成部分,為患者提供每日所需的L-亮氨酸[1],具有促進胰島素分泌[2-3],抑制胰高血糖素分泌[4-5],減少體內氮消耗,促進肌肉合成[6-7],降低肌肉分解的作用[8-9],在食品、醫藥、飼料等方面應用廣泛[10]。

α-酮異己酸最常用的生產方法是化學合成法,包括用二乙基草酰胺與格氏試劑加成產物的水解反應、雙羰基化法和海因法等[11]。這些方法均需高成本的催化劑或特殊的起始結構,使得α-酮異己酸的生產成本較高。其次,還需使用有毒反應物,對環境造成嚴重危害。目前,生物法合成α-酮異己酸的研究越來越多,主要是發酵法和全細胞轉化法[12]。BüCKLE-VALLANT等[13]通過代謝工程改造谷氨酸棒桿菌實現了α-酮異己酸的直接發酵生產,但產量低(9.23 g/L),還存在副產物α-酮異戊酸及氨基酸缺陷型問題。為解決氨基酸缺陷型問題,改變了轉氨酶B編碼基因ilvE的起始密碼子并將不同拷貝的基因整合到基因組上,α-酮異己酸含量達到6.1 g/L,但這種方法并沒有完全解決氨基酸缺陷問題,且發酵過程仍需添加多種昂貴的氨基酸,副產物也較多[14],由此可見,基于代謝工程的α-酮異己酸合成方法存在產量低、副產物多,且需要添加多種昂貴氨基酸,不適合工業化生產。

全細胞轉化法由于副產物少、操作簡單、合成步驟少,而且反應過程中,無需添加有毒化學原料,產品純度高,易于分離純化,更適合工業化生產。普通變形桿菌Proteusvulgaris來源的膜結合型L-氨基酸脫氨酶(L-amino acid deaminase,L-AAD)能夠催化L-亮氨酸脫氨基生成α-酮異己酸而不產生H2O2,從而減少對宿主細胞生長的影響[15-16],已被廣泛應用于各種α-酮酸的合成,如苯丙酮酸[17]、α-酮異戊酸[18]、α-酮戊二酸[19-20]、α-酮基-γ-甲基硫代丁酸[21]和α-酮異己酸[22]。圖1所示為P.vulgaris來源的L-AAD脫氨基反應過程中的元素以及α-酮異己酸和L-亮氨酸之間化學結構的變化。

圖1 P.vulgaris 來源的L-AAD的脫氨基反應

目前,ZHU等[23]利用不透明紅球菌 DSM 43250進行全細胞轉化合成產量達1.27 g/L的α-酮異己酸。SONG等[24]將P.vulgaris來源的L-AAD在大腸桿菌異源表達,以構建的重組菌的菌體作為全細胞催化劑轉化L-亮氨酸獲得69.1 g/L的α-酮異己酸。之后,通過使用不同拷貝數的質粒、調節起始密碼子下游的mRNA組成、設計核糖體結合位點序列這3種策略實現了α-酮異己酸的更高產,產量達到86.55 g/L[25]。

雖然,在大腸桿菌中α-酮異己酸產量已達到較高水平,但大腸桿菌可能會將不符合食品衛生要求的有害物質帶入產品中,因此,需構建背景清晰的食品級表達系統,以實現α-酮異己酸的安全生產?？莶菅挎邨U菌是非致病性細菌,被美國食品藥物管理局普遍認為是GRAS(Generally Recognized As Safe)菌株。此外,目前還沒有P.vulgaris來源的L-AAD在枯草芽孢桿菌中異源表達以合成α-酮異己酸的相關研究報道。因此,本研究選用食品安全性菌株Bacillussubtilis168作為宿主細胞,異源表達了P.vulgaris來源的L-AAD,構建了重組菌株B.subtilis168/pMA5-lad。之后,針對全細胞生物合成α-酮異己酸的催化體系進行優化,并將固定化細胞技術用于α-酮異己酸的生物合成,實現了以L-亮氨酸為底物一步法生物合成α-酮異己酸,為α-酮異己酸及其他重要α-酮酸的工業化安全合成提供了一種新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

本研究中所用到的質粒pMA5、菌株EscherichiacoliJM109、Bacillussubtilis168均為本實驗室保藏。pUC57-lad質粒為蘇州金唯智生物科技有限公司人工合成。

1.1.2 實驗試劑

BamH I、MluI限制性快切酶、10 000 bp核酸marker和蛋白Marker,大連寶生物公司；高保真酶、同源重組酶克隆試劑盒,南京諾維贊生物科技有限公司；小量質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,上海捷瑞生物工程有限公司；α-酮異己酸標品,Sigma公司;L-亮氨酸、海藻酸鈉、CaCl2及培養基原料,國藥。

1.1.3 培養基

LB培養基：蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%和氯化鈉 1%,固體培養基則加1.5%～2.0%的瓊脂粉,根據需要加入相應濃度抗生素。

種子培養基：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、K2HPO40.23%、KH2PO40.17、MgSO40.075%、NaCl 0.5%,pH 6.8～7.0,根據需要加入相應濃度抗生素。

發酵培養基：大豆蛋白胨1%、玉米漿0.5%、檸檬酸銨0.3%、葡萄糖4%、K2HPO40.23%、KH2PO40.17%、MgSO40.075%、NaCl 0.5%,pH 6.8～7.0,根據需要加入相應濃度抗生素。

注：培養基配方中的“%”均為質量分數。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌株B.subtilis168/pMA5-lad的構建

將NCBI數據庫查詢到的P.vulgaris來源的L-氨基酸脫氨酶編碼基因lad(GeneBank登錄號：AB030003.1)序列提交至蘇州金唯智生物科技有限公司進行合成,并進行密碼子優化,以利于其在B.subtilis168的異源表達。

以公司提供的pUC57-lad重組質粒為模板,以lad-F：gtgaaatcagggggatccatggccattagccgccgc(BamH I)和lad-R：tcgacctctagaacgcgtttaaaaacgatataaagaaaacggct-tcggg(MluI)為引物進行PCR擴增,PCR產物純化后與經BamH I和MluI雙酶切線性化的pMA5質粒進行連接并轉化E.coliJM109感受態細胞,涂布含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上,于37 ℃培養箱倒置培養8～12 h。挑取轉化子進行培養,提取重組質粒進行單雙酶切驗證,驗證正確的重組質粒送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序分析,測序正確的重組質粒命名為pMA5-lad。

將重組質粒pMA5-lad轉化B.subtilis168感受態細胞,涂布至含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上,于37 ℃培養箱倒置培養8～12 h。挑取轉化子進行菌落PCR驗證,驗證正確的重組菌株命名為B.subtilis168/pMA5-lad。

1.2.2L-AAD的表達

首先,將凍管保存的B.subtilis168/pMA5-lad重組菌株在含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上劃線活化,挑取單菌落轉接10 mL 50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基,37 ℃、200 r/min下培養8～12 h后,按10%(體積分數)接種量轉接50 mL含相同濃度的LB液體培養基,37 ℃、180 r/min下培養24 h,以誘導L-AAD的表達。之后,在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min收集細胞,棄去培養基,細胞菌體用5 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)洗2次。最后,將細胞菌體懸浮于5 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)中并用超聲破碎儀進行破碎,破碎液在4 ℃下離心20 min,收集上清液,用于后續的SDS-PAGE分析和酶活力測定。對照菌株B.subtilis168/pMA5按照同樣的方法進行誘導表達。

1.2.3 酶活力測定與底物特異性研究

1.2.4 全細胞生物催化劑的制備

首先,將凍管保存的B.subtilis168/pMA5-lad重組菌株在含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上劃線活化,挑取單菌落轉接10 mL 50 μg/mL卡那霉素的種子培養基,37 ℃、200 r/min下培養8～12 h后,按10%(體積分數)接種量轉接100 mL含相同濃度卡那霉素的發酵培養基,37 ℃、180 r/min下培養24 h,以誘導L-AAD表達。之后,在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min收集細胞,棄去培養基,用 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)洗滌菌體2次。最后,將重組枯草芽孢菌體懸浮于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0),測定OD600,并轉化為細胞干重(DCW),轉化公式為(1)：

DCW/(g·L-1)=0.444 2×OD600-0.021

(1)

1.2.5 全細胞催化條件優化

(1)菌體濃度的優化

分別投加不同量的重組枯草芽孢桿菌的菌體于含有100 mmol/LL-亮氨酸的50 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)中,使反應體系中菌體終質量濃度分別為5、10、15、20和25 g/L,37 ℃下反應24 h,離心取上清液,HPLC檢測α-酮異己酸濃度。

(2)反應溫度的優化

用含100 mmol/LL-亮氨酸的50 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)重懸重組枯草芽孢桿菌的菌體,使菌體質量濃度維持在20 g/L,不同溫度(25、30、35、40、45、50、55 ℃)下反應24 h,離心取上清液,HPLC檢測α-酮異己酸濃度。

(3)反應pH的優化

將20 g/L重組枯草芽孢桿菌菌體和100 mmol/LL-亮氨酸溶解于不同pH(6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0)的50 mL KH2PO4-K2HPO4緩沖液中,于45 ℃下反應24 h,離心取上清液,HPLC檢測α-酮異己酸濃度。

(4)底物L-亮氨酸濃度的優化

在含有20 g/L重組枯草芽孢桿菌菌體的50 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 10.0)中,分別投加不同量的L-亮氨酸,使L-亮氨酸終濃度為50、75、100、125和150 mmol/L,45 ℃下反應24 h,離心取上清液,HPLC檢測α-酮異己酸濃度。

1.2.6 金屬離子對全細胞催化體系的影響

在含有20 g/L重組枯草芽孢桿菌菌體、100 mmol/LL-亮氨酸的50 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 10.0)中添加5 mmol/L Ca2+、Fe2+、Mg2+、Na+、Ba2+、Cu2+、Li+和Al3+),于45 ℃下反應24 h,離心取上清液,HPLC檢測α-酮異己酸濃度,以評估不同金屬離子對全細胞生物催化體系的影響。以不添加任何離子的反應混合物作為對照。

1.2.7 細胞固定化

將重組枯草芽孢桿菌細胞與30 g/L海藻酸鈉溶液按1∶1比例進行混合,用帶有針頭的注射器將混合液滴入到預冷的CaCl2溶液(136 mmol/L)中,4 ℃下放置1 h,使所得珠粒硬化,然后過濾,收集固定化細胞并用無菌水洗滌2次,以去除過量的Ca2+和未結合的細胞[19]。

利用游離細胞及固定化細胞作為全細胞催化劑,重復批次進行轉化,測試全細胞催化劑的可回收性,即可再利用性。反應在裝有1 g游離細胞/固定化細胞的50 mL/500 mL三角瓶中進行(DCW終質量濃度20 g/L),45 ℃、200 r/min搖床反應24 h,離心,回收上清液,HPLC檢測α-酮異己酸濃度。然后將反應溶液分別繼續加入到相應的細胞沉淀中,45 ℃、200 r/min搖床反應24 h,離心,回收上清液,HPLC檢測α-酮異己酸濃度。共重復3個循環,將第1次轉化結束時,轉化液中α-酮異己酸的含量定義為100%。

1.2.8 α-酮異己酸的HPLC檢測分析

采用伯樂AminexHPX-87H(300 mm×7.8 mm,9 μm)色譜柱,流動相為5 mmol/L的H2SO4溶液,流速為0.6 mL/min,柱溫為35 ℃,進樣量10 μL,在紫外檢測波長203 nm下檢測α-酮異己酸含量[19]。

2 結果與分析

2.1 B.subtilis 168/pMA5-lad重組菌株的構建與表達

以lad-F和lad-R為引物,以pUC57-lad質粒為模板,PCR擴增獲得含同源臂的lad基因片段,基因大小為1 416 bp,回收后的lad基因片段與pMA5線性化質粒進行同源重組連接,連接產物轉化E.coliJM109。提取重組質粒并進行單雙酶切驗證(圖2-a),驗證正確的重組質粒送公司進行測序分析,測序正確的重組質粒命名為pMA5-lad。重組質粒pMA5-lad轉化B.subtilis168感受態細胞,轉化子菌落PCR驗證正確的重組菌株命名為B.subtilis168/pMA5-lad(圖2-b)。

P.vulgaris來源的L-氨基酸脫氨酶是一種膜結合型蛋白,用1.2.2所述方法進行L-AAD的誘導表達,SDS-PAGE結果顯示,B.subtilis168/pMA5-lad上清液在51 kDa附近有條帶加粗,即L-AAD成功實現了在B.subtilis168中的異源表達(圖2-c)。

a-重組質粒單雙酶切驗證結果,泳道M：10 000 bp核酸Marker,泳道1、3、5為重組質粒單酶切驗證結果,泳道2、4、6為重組質粒雙酶切驗證結果；b-泳道M：10 000 bp核酸Marker,泳道1、2、3、4為轉化子菌落PCR驗證結果；c-L-AAD在B.subtilis 168中的表達,泳道1為重組菌株B.subtilis 168/pMA5-lad細胞破碎上清液,泳道2為對照菌株B.subtilis 168/pMA5細胞破碎上清液

2.2 L-AAD酶的酶活測定與底物特異性研究

不同來源的L-AAD的底物類型不同,一般多數L-AAD的底物范圍較廣(主要是天然氨基酸),來自厚葉藻類(Amphiroacrassissima)的L-AAD 可以催化脂肪族、芳香族、基本的、硫化的、γ-羧化的氨基酸[27]。來自老鼠腎臟的L-AAD 可以催化像S-腺苷-L-高半胱氨酸、高半胱氨酸、腺苷蛋氨酸等天然氨基酸衍生物[28]。來自不透明紅球菌的L-AAD 底物范圍更廣,不僅可以利用20種常見氨基酸,而且還能利用19種氨基酸衍生物[29]。接下來,對P.vulgaris來源的L-AAD進行功能驗證,同時測試其底物特異性,探索研究了L-AAD對亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、精氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、絲氨酸、脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、纈氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸這18種氨基酸的底物特異性,結果顯示,P.vulgaris來源的L-AAD的底物范圍較廣,其中,對絲氨酸的特異性最高,其次是丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸(圖3),以A520最高的定義為100%。

圖3 L-AAD的底物特異性

2.3 全細胞催化條件的優化

2.3.1 菌體濃度的優化

菌體濃度在一定程度上反映了酶的含量,因此,測試了不同菌體質量濃度(5、10、15、20和25 g/L)對生物轉化合成 α-酮異己酸的影響,結果如圖4所示,DCW在5～20 g/L范圍內,隨著DCW質量濃度增大,反應體系中L-AAD增多,生化反應過程加快,α-酮異己酸含量逐漸增多。DCW質量濃度達20 g/L時,α-酮異己酸含量達到最高,為1.59 g/L。當DCW質量濃度高于20 g/L時,可能是菌體質量濃度過高時,菌體的生長也需要大量的氧氣,L-AAD氧化脫氨反應也是一個耗氧過程,不利于脫氨反應的進行,因此,α-酮異己酸含量逐漸下降,即高細胞密度不利于生物轉化合成α-酮異己酸。由此可見,全細胞生物轉化合成 α-酮異己酸的最適菌體質量濃度為20 g/L。

圖4 菌體濃度對全細胞催化反應的影響

2.3.2 反應溫度的優化

溫度通過影響酶促反應速率進而影響α-酮異己酸的合成?？刂瞥跏紁H 7.0、底物L-賴氨酸濃度為100 mmol/L、菌體量DCW為20 g/L,分別在25、30、35、40、45和55 ℃下進行全細胞轉化合成α-酮異己酸,結果如圖5所示。在25～45 ℃范圍內,α-酮異己酸的含量隨著溫度升高而升高,當溫度為45 ℃時,α-酮異己酸的含量最高,為1.92 g/L。而溫度高于45 ℃時,α-酮異己酸的含量則逐漸下降。由此可見,全細胞生物轉化合成 α-酮異己酸的最適反應溫度為45 ℃,這可能與L-AAD的最適反應溫度有關。

圖5 反應溫度對全細胞催化反應的影響

2.3.3 反應pH的優化

維持反應溫度45 ℃、底物L-賴氨酸濃度為100 mmol/L、菌體量DCW為20 g/L,其他條件相同情況下,在初始pH分別為6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0下進行全細胞轉化合成α-酮異己酸,結果如圖6所示。在pH 6.0～10.0范圍內,α-酮異己酸的含量隨著pH升高而升高,當pH為10.0時,α-酮異己酸的含量最高,為2.27 g/L。而pH高于10.0時,α-酮異己酸的含量則逐漸下降。由此可見,全細胞生物轉化合成 α-酮異己酸的最適反應pH為10.0,可能與L-AAD的最適反應pH有關。

圖6 反應pH對全細胞催化反應的影響

2.3.4 底物L-亮氨酸濃度的優化

底物L-亮氨酸濃度是全細胞轉化合成α-酮異己酸的重要因素?？刂品磻獪囟?5 ℃、初始pH 10.0、菌體量DCW為20 g/L,在底物L-賴氨酸濃度分別為50、75、100、125和150 mmol/L條件下進行生物轉化,考察底物L-亮氨酸濃度對全細胞轉化合成α-酮異己酸的影響,結果如圖7所示。底物在較低濃度50～100 mmol/L濃度范圍內,L-AAD的催化效率逐漸提高,α-酮異己酸濃度隨底物濃度升高而升高；底物濃度超過100 mmol/L時,可能L-AAD酶活性受到抑制,L-AAD酶活性降低,生物轉化過程變慢,α-酮異己酸濃度降低。由此可見,全細胞生物轉化合成 α-酮異己酸的最適底物L-亮氨酸濃度為100 mmol/L,此時,α-酮異己酸含量高達2.27 g/L。

圖7 底物L-亮氨酸濃度對全細胞催化反應的影響

2.4 金屬離子對全細胞催化體系的影響

測試了分別添加5 mmol/L CaCl2、FeCl2、MgCl2、NaCl、BaCl2、CuCl2、LiCl和AlCl3對全細胞轉化合成α-酮異己酸的影響,結果如圖9所示。Ca2+、Fe2+、Ba2+和Cu2+的存在抑制了L-AAD酶的活性,不利于全細胞轉化合成α-酮異己酸,而Mg2+、Na+、Li+和Al3+的存在對L-AAD酶的活性起激活作用,因此,促進了α-酮異己酸的合成(圖8),尤其是Mg2+的存在,使得α-酮異己酸濃度提高了60.79%。

圖8 不同金屬離子對全細胞催化反應的影響

2.5 細胞固定化

細胞固定化是提高全細胞生產率的常用技術,固定化細胞比游離細胞更容易分離細胞和產物。另外,細胞的固定化允許連續操作而無需細胞沖洗和稀釋反應溶液,這可以用來克服由于高濃度的底物或產物而產生的任何抑制作用[30]。

本文研究了細胞固定化對生物轉化合成α-酮異己酸的影響。從圖9-a可以看出,控制條件完全一致情況下,固定化細胞轉化所獲得的α-酮異己酸含量(2.56 g/L)要率低于游離細胞轉化所獲得的α-酮異己酸含量(3.66 g/L),這可能是固定化細胞生物催化劑由于受到海藻酸鈉屏蔽作用,減少了基質和細胞之間的接觸面積,因此,反應速率有所下降,α-酮異己酸含量降低。

a-細胞固定化對全細胞轉化合成α-酮異己酸的影響；b-游離細胞及固定化細胞的重復批次轉化

但是,固定化細胞催化劑在重復3次轉化中顯示出優異的性能(圖9-b),再利用率提高了37.3%。這是由于L-AAD與海藻酸鈉的交聯作用使得L-AAD更加穩定,可保護細胞免受外部環境影響。

3 討論

本文首次成功實現了P.vulgarise來源的L-AAD在食品安全菌株B.subtilis168中的異源表達,構建了重組枯草芽孢桿菌B.subtilis168/pMA5-lad,以20 g/L的重組枯草芽孢桿菌B.subtilis168/pMA5-lad菌體作為全細胞催化劑,在L-亮氨酸濃度100 mmol/L、反應溫度45 ℃、pH 10.0、MgCl2濃度5 mmol/L的最優轉化條件下,連續轉化24 h,可實現一步法生物合成α-酮異己酸,α-酮異己酸含量達3.66 g/L,產率為0.15 g/(L·h),在細胞固定化及重復批次轉化實驗中,固定化細胞的再利用率提高了37.3%。

BüCKKE-VALLANT等[13]利用谷氨酸棒桿菌直接發酵獲得了9.23 g/L的α-酮異己酸,產率達0.17 g α-酮異己酸/g葡萄糖,存在副產物多及氨基酸缺陷問題；之后,為解決氨基酸缺陷問題構建的谷氨酸棒桿菌直接發酵可獲得6.1 g/L的α-酮異己酸,產率卻僅為0.014 g α-酮異己酸/g葡萄糖,而且未完全解決氨基酸缺陷問題[14]。雖然,目前,大腸桿菌全細胞轉化合成α-酮異己酸的產量已高達86.55 g/L,產率達到3.6 g/(L·h)[25],處于較高水平,但大腸桿菌可能會將不符合食品衛生要求的有害物質帶入產品中,限制了α-酮異己酸在食品、醫藥行業的應用。本研究構建的可實現α-酮異己酸安全生產的重組枯草芽孢桿菌,雖然產量不高,僅達3.66 g/L,且產率僅為0.15 g/(L·h),但為α-酮異己酸的工業化安全生產提供了一種新策略。在接下來研究中,將會對L-AAD的結構和功能進行分析,采取有效策略,對L-AAD進行理性改造,以進一步提高L-AAD的酶活水平,提高生物轉化效率,進而提高α-酮異己酸的產量。