江西地區育齡血紅蛋白H患者的基因型與表型分析及產前診斷

羅海艷 陸清 謝康 鄒永毅 黃婷 劉艷秋

江西省婦幼保健院產前診斷中心（南昌330006）

地中海貧血（地貧）是一種高發于中國南方地區的血液系統常染色體隱性疾病，主要類型有α-地貧和β-地貧［1-2］。根據受累的α-珠蛋白基因個數，可將α-地貧分為靜止型、輕型、中間型和重型四類。血紅蛋白H（HbH）病是一組中間型α-地貧，患者由于缺失3 個α-珠蛋白基因或因缺失2 個α-珠蛋白基因且復合α-珠蛋白基因非缺失突變導致α-鏈合成顯著減低，多余的β-鏈聚合為四聚體（β4）即HbH。四聚體易解離并沉積形成包涵體，引起紅細胞破壞發生慢性溶血性貧血，是可存活的α-地貧中最嚴重的一種［3-5］。HbH 病是一種分子遺傳學機制異質性較大的疾病，其基因變異類型與頻率存在著明顯的種族與地域差異［6-7］。此外，HbH 患者臨床表型個體差異較大，貧血程度各異，通常表現為輕度至中度貧血，輕者血紅蛋白可為正常，重者可出現肝脾腫大、骨骼畸形與發育異常，甚至需依賴輸血維持生命［8］。目前，在我國一些地貧高發省份如廣西、廣東、海南等，已有不同人群HbH 病基因型頻率以及血液學特點相關研究，為當地的地貧遺傳咨詢與出生缺陷防控提供依據［9-11］。江西地區地處中國南方，是國家地貧防控的重點區域，目前尚缺乏該地區HbH 病的基因型頻率與臨床表型相關研究。本研究對江西地區育齡人群HbH 患者的基因型及血液學表型進行分析，同時為符合地貧產前診斷指征的HbH 患者提供產前診斷，不僅可為江西省HbH 病的臨床遺傳咨詢提供指導，對出生缺陷防控的實踐也具有重要參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇自2017年3月至2019年12月在江西省婦幼保健院就診的育齡受檢者9 883 例（年齡18 ～46 歲），研究對象主要來自于常規體檢、孕前檢查、產前檢查、優生遺傳咨詢、輔助生殖術門診，所有受檢者均否認近1年內有輸血史，所有檢測均獲得受檢者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 血常規檢測采用邁瑞2000 血液分析儀分析患者血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均血紅蛋白含量（mean corpuscular volume，MCH）等參數。成人MCV 參考區間為82 ～92 fL，MCH 參考區間為27 ～31 pg。當男性Hb ＜120 g/L 或女性＜110 g/L，MCV ＜82 fL 或/且MCH ＜27 pg 時可判斷為小細胞低色素性貧血。

1.2.2 血紅蛋白電泳檢測采用法國Sebia 公司生產的CAPPILLARY S2 FLEX PIERCING 全自動毛細管電泳儀及配套試劑行血紅蛋白電泳檢測，分析患者HbA2、HbH、Hb Bart′s 帶含量，成人HbA2值的參考區間為2.2%～3.5%。

1.2.3 介入性產前診斷穿刺于合適孕周在B 超引導下行介入性穿刺術采集胎兒標本，排除胎兒標本中母體細胞污染后行地貧基因檢測。絨毛膜穿刺術的適用孕周為11 ～13+6周，羊膜腔穿刺術為18 ～28 周，臍帶血穿刺術為＞28 周。

1.2.4 外周血及羊水gDNA提取嚴格按照Qiagen血液組織DNA 提取試劑盒（Qiagen，德國）說明書提取外周血與羊水細胞gDNA，使用微量紫外分光光度計（Nanodrop 2000）測定DNA 濃度并調節濃度至50 ～100 ng/μL 備用。

1.2.5 常規地貧基因檢測使用Gap-PCR 結合瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測α-珠蛋白基因3 種常見缺失（--SEA/、-α3.7/、-α4.2/），采用PCR 結合反向斑點雜交法（DOT-RDB）檢測α-珠蛋白基因的3 種常見點突變（αWSα/、αCSα/和αQSα/）及β-珠蛋白基因的17 種常見點突變，即CD41-42（-TTCT）、CD43（G→T）、IVS-II-654（C→T）、-28（A→G）、-29（A→G）、-30（T→C）、-32（C→A）、CD71-72（+A）、βE（GAG→AAG）、CD17（A→T）、CD31（-C）、CD14-15（+G）、CD27/28（+C）、IVS-I-1（G→C）、IVS-I-5（G→C）、CAP（-AAAC）和IntM（ATG.→AGG），PCR 反應體系及擴增條件嚴格按照試劑盒（亞能生物技術公司，深圳）進行操作。

1.2.6 罕見地貧基因檢測對經血紅蛋白電泳提示HbH 帶而常規地貧基因檢測為非HbH 基因型的患者，行進一步罕見地貧基因檢測。使用Gap-PCR 結合瓊脂糖凝膠電泳檢測HKαα、--THAI（泰國型）、anti4.2、-α27.6、-α21.9、α fusion gene（α融合基因）等罕見α-地貧，檢測試劑盒購自深圳亞能生物技術有限公司。使用PCR 結合Sanger 測序的方法檢測α2 與α1 基因上的罕見點突變或新突變，引物序列參照徐湘民《地中海貧血預防控制操作指南》［12］。

1.3 妊娠結局隨訪對行產前診斷的孕婦行妊娠結局隨訪，對出生的新生兒定期行血常規結果隨訪。

1.4 統計學方法采用Microsoft Excel 2003 軟件對基因型與血液學檢測結果進行統計學分析。

2 結果

2.1 江西地區育齡HbH患者基因型分析9 883例育齡受檢者中共檢出34例HbH患者，共計8種基因型，檢出率為0.34%（34/9 883）。其中缺失型HbH患者31例（91.2%），非缺失型HbH患者3例（8.8%）。按是否合并β-地貧，可將缺失型HbH 患者分為單純性HbH 病與合并β-地貧HbH 病兩類。其中單純性缺失型HbH 患者共28 例，19 例基因型為-3.7α/--SEA（67.9%），9 例基因型為-4.2α/--SEA（32.1%）；合并β-地貧缺失型HbH 病患者3 例，其基因型分別為-3.7α/--SEA 合并β-地貧CD41-42 雜合突變，-3.7α/--SEA 合并β-地貧IVS-II-654 雜合突變，以及αQSα/--SEA 合并β-地貧CD41-42 雜合突變。3 例非缺失型HbH 患者基因型分別為αWSα/--SEA，CSα/--SEA 與國內首次報道的非缺失型αCD61（AAG ＞TAG）α/--SEA，江西地區34 例育齡HbH 患者的基因型分析見表1。

表1 江西地區34 例育齡HbH 患者的基因型構成及頻率Tab.1 Genotypes and frequency of 34 patients with HbH disease in Jiangxi province

2.2 34例HbH患者血液學表型分析血常規結果顯示34 例HbH 患者均表現出小細胞低色素的血液學特點，MCV與MCH參數較參照值相比明顯降低，其MCV值為（62.61±9.86）fL（范圍為48.3 ～71.6 fL），MCH 值為（17.4 ± 2.1）pg（范圍為13.8 ～21 pg），不同基因型之間MCV與MCH值存在一定差異。34例HbH 患者除1 例HbH-WS 女性Hb 值正常外，其余33 例HbH 患者貧血程度表現出個體差異，其Hb 值介于71 ～117 g/L之間，呈輕度貧血者12例（36.4%），呈中度貧血者21 例（63.6%）。血紅蛋白電泳結果顯示31 例單純性HbH 患者HbA2 值降低，為（1.35±0.25）%，范圍為0.7%～1.8%，表現出α-地貧血液學特點，而3 例合并β-地貧HbH 患者經血紅蛋白電泳檢測HbA2 值均升高（＞3.5%），僅表現出β-地貧的特點而掩蓋了α-地貧的血液學特征。34 例HbH患者中僅有30例經血紅蛋白電泳出現HbH帶，其含量為（6.8±1.2）%，范圍為2.1%～11.9%，4例未出現HbH 條帶的患者分別為WS-HbH 病1 例，合并β-地貧HbH 病3 例；僅23 例患者經血紅蛋白電泳出現Hb Bart′s 帶，其含量為（1.0 ± 0.1）%，范圍為0.3%～2.0%；HbH 與Hb Bart′s 條帶的含量未表現出與基因型或貧血程度的明顯相關性。對同一基因型的HbH 患者而言，整體上女性Hb 值明顯低于男性，貧血程度比男性嚴重，這可能與女性的妊娠或營養等生理狀態相關；而相同HbH 基因型的女性患者與男性患者相比，其MCV 值、MCH 值及HbA2值與性別無明顯相關性。由于本研究中不同基因型的育齡HbH 患者病例數差異較大，未對不同基因型之間的血液學表型差異行統計學分析。34 例HbH 患者的基因型及相關血液學表型詳見表2。

表2 34 例HbH 患者的基因型與血液學表型Tab.2 Genotypes and hematological parameters of 34 patients with HbH disease

2.3 HbH患者產前診斷結果分析對34例HbH 患者的配偶行地貧基因檢測，發現有5 對夫妻為同型地貧攜帶者，3 對為同型α-地貧攜帶者，2 對為同型β-地貧攜帶者，符合地貧產前診斷指征。產前診斷結果顯示1 例胎兒為Hb Bart′s 水腫胎，其基因型為--SEA/--SEA，1 例胎兒為重型β-地貧，其基因型為βIVS-II-654β-28，1 例胎兒為缺失型HbH 病，其基因型為-3.7α/--SEA，其余2 例胎兒分別為α-地貧與β-地貧攜帶者，5 個行地貧產前診斷的家系信息及產前診斷結果見表3。

表3 行地貧產前診斷的5 個家系Tab.3 Five families with prenatal diagnosis of thalassemia

2.4 妊娠結局隨訪家系1 與家系2 中的2 例孕婦選擇終止妊娠，其余3 個家系選擇繼續妊娠。胎兒出生后進行隨訪，3 例胎兒均足月順產，阿氏評分為10 分。家系3 中胎兒6月齡血常規結果示Hb 值為107 g/L，MCV 為72 fL，MCH 為24 pg，呈輕度小細胞低色素貧血，家系4 中胎兒6月齡體檢時血常規結果未見異常，家系5 中胎兒6月齡體檢時血常規結果示Hb 值為120 g/L，MCV 為70 fL，MCH為25 pg，僅表現出小細胞低色素而無貧血的血液學特點。后期將對上述5 個家系繼續隨訪。

3 討論

地中海貧血是一種隨地理區域與種族不同而存在明顯基因型差異的疾病，HbH 病作為一種可存活的最嚴重的α-地貧，在不同的α-地貧高發地區具有其獨特的發生率與基因突變譜。此外，HbH 病分子基礎異質性高，不同基因型的個體、相同基因型的不同個體、甚至同一個體在不同階段的貧血程度均有較大差異，這給臨床遺傳咨詢帶來了很大的困難。江西省位于中國南部，是國家地貧防控的十個重點省份之一。HbH 病在該地區人群中也有一定的發生率［13］，但目前尚缺乏關于該地區HbH 病的基因型頻率與血液學分析的研究，因此對該地區育齡人群進行HbH 病的基因檢測與遺傳咨詢至關重要。

本研究針對9 883例大樣本量的育齡受檢者進行地貧基因檢測，檢出江西地區育齡人群HbH病的發生率約為0.34%（34/9 883）。與廣西［9］、廣東［14-15］、海南［16］、云南［17］等地的發生率相比，明顯低于上述幾個區域。在基因型頻率方面，江西省缺失型HbH病-α3.7/--SEA 與-α4.2/--SEA 所占比例明顯高于非缺失型，與相鄰的廣東與福建兩省相似，而與廣西地區差異較大。在黃雅莉等［18］關于廣東湛江地區HbH 病的研究中，該地區缺失型HbH 頻率均高于非缺失型HbH；在付春云等［19］對廣西地區HbH病的研究中，最常見的基因型為-α3.7/--SEA，其次為αCSα/--SEA，非缺失型αCSα/--SEA 發生率高于缺失型-α4.2/--SEA。此外，江西地區也具有其獨特的HbH病基因突變譜，如本研究中檢出了目前國內尚未報道過的αCD61（AAG＞TAG）α/--SEA 基因型。隨著后續樣本量的擴大，可能檢出更多具有地區特異性的HbH 基因型。

以往研究［20］認為，基因型為-α3.7/--SEA 或-α 4.2/--SEA 的個體，臨床表現呈輕度到中度貧血，而基因型為αCSα/--SEA、αQSα/--SEA 的個體較-α3.7/--SEA 及-α4.2/--SEA 個體相比可表現為更嚴重的貧血，對于基因型為αWSα/--SEA 的個體，雖然為3 個α-基因受累的HbH 病類型，但此類患者一般不貧血或僅為輕度貧血。在本研究中，除1 例αWSα/--SEA女性HbH 患者Hb 值正常，其余患者均由基因型、年齡、性別等因素不同而表現出不同程度的小細胞低色素貧血，與既往研究中HbH 患者的臨床表型相似。33 例有貧血表型的HbH 患者中，輕度貧血者12 例（36.4%），中度貧血者21 例（63.6%），表明在育齡人群HbH 患者的貧血程度主要為中度貧血，少部分表現出輕度貧血。對同一HbH 基因型的患者而言，整體上女性貧血比男性嚴重，可能與女性的特殊生理因素或妊娠因素有關。此外，單純性HbH 患者HbA2 值降低（＜2.2%），表現出α-地貧特點，而合并有β-地貧的HbH 患者HbA2 值升高（＞3.5%），僅表現出典型的β-地貧而掩蓋了α-地貧血液學特征。這提示了對血液學提示HbA2 值升高的受檢者，一定要同時檢測α-地貧避免漏檢；30 例HbH 患者經血紅蛋白電泳后出現HbH 帶，4例HbH者電泳后未出現HbH帶。4例未出現HbH條帶的患者中，1 例WS-HbH 患者由于未表現出貧血而無HbH 條帶，3 例合并β-地貧的HbH 患者可能由于攜帶了β-地貧而導致β4 聚合體含量降低，血紅蛋白電泳后未出現HbH 條帶。這提示基于HbH 條帶等血液學指標篩查HbH 病可能存在漏檢，其診斷需依賴基因檢測。臨床上，HbH 患者的配偶必須行地貧基因檢測，因為僅通過篩查配偶血常規與血紅蛋白電泳無法評估該家庭生育嚴重HbH 患兒的風險。本研究中行產前診斷的5 個家系中，胎兒為重型α-地貧與重型β-地貧的兩個家庭選擇了終止妊娠。胎兒基因型為-α3.7/--SEA 的家庭在充分知情前提下，選擇繼續妊娠，建議父母對其定期行血常規檢查監測貧血并特殊護理，以及成年后婚育時進行遺傳咨詢。其余2 例胎兒為α-與β-地貧攜帶者的家庭，建議其成年后婚育時進行遺傳咨詢。

本研究仍然存在一定的局限性。首先，要系統地對江西地區育齡HbH 患者進行基因型頻率分析，尚有待更大規模受檢者樣本量的積累；其次，在檢測方法上，采用高通量捕獲測序（next generation sequencing，NGS）結合Gap-PCR 可更有效地檢測出罕見HbH 病，而在本研究中，僅基于患者血紅蛋白電泳出現HbH 帶的血液學特點時，才對受檢者行罕見地貧基因檢測，可能存在漏檢罕見HbH患者的情況。

綜上，本研究首次報道了江西地區育齡HbH患者的發生率與基因型構成及臨床表型，發現了目前國內尚未報道過的αCD61（AAG＞TAG）α/--SEA 基因型，豐富了江西地區地中海貧血的基因突變譜；同時為有生育中、重型地貧患兒的家庭提供產前診斷，為育齡人群HbH 病的遺傳咨詢及后續產前診斷提供了重要的參考價值，對完善出生缺陷防控具有重要意義。