菊黃東方鲀精巢醇提物（AETT）的抗疲勞作用與毒理安全性

劉淑集，廖登遠，李水根，蘇永昌，蘇 捷，劉智禹

（1.福建省水產研究所//國家海水魚類加工技術研發分中心（廈門）//福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室//福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心，福建 廈門，361013；2.福建海洋職業技術學校，福建 福州，350000）

疲勞是現代社會一種常見的亞健康狀態，長期處于疲勞狀態，會使機體發生內分泌紊亂，抵抗力和免疫力逐漸下降，引起早衰，甚至會引發一些潛在的慢性疾病急性發作，出現器質性病變[1-2]。因此，緩解疲勞，改善人體亞健康狀態受到人們越來越多的重視，研究開發具有抗疲勞功能食品或營養食品極具市場前景。如蔡亞偉等[3]研究發現牡蠣（Ostrea gigas）肉提取物可以提高小鼠的抗疲勞能力和耐缺氧能力，增強小鼠的免疫力；劉嫻[4]制備的青石斑（Chromileptes altivelis）魚肉多肽能降低小鼠血清尿素氮的含量，提高小鼠肝糖原含量，具有較好的抗疲勞作用；董陳潁等[5]研究的鮭（Salmo sala）蛋白（肽）能顯著延長小鼠力竭游泳時間，降低血清尿素氮含量，具有明顯的抗疲勞作用。

河鲀是一種高蛋白、低脂肪的魚類，其精巢具有養精固氣、滋陰補陽的功效[6]，在日本民間有用河鲀精巢泡酒飲用的風俗。但河鲀精巢泡酒發揮保健功效的成分及其是否有毒性等至今均未有研究報道。菊黃東方鲀（Takifugu flavidus）屬于鲀科東方屬，屬于溫帶近海底層魚類，是我國福建省養殖的主要河鲀品種之一。養殖的菊黃東方鲀的魚肉、魚皮、魚骨、精巢均是無毒的，河豚毒素的測定結果低于限值，屬于D 級（無毒）[7]。因此，本研究以食用酒精浸泡菊黃東方鲀精巢制備的醇提物［alcohol extract of testis from T.flavidus（AETT）］為原料，通過小鼠實驗測定小鼠的負重游泳時間和血清尿素氮、血清乳酸、肝糖原含量的變化，研究其抗疲勞功效及毒理安全性，以期為河鲀精巢抗疲勞保健酒開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小白鼠（北京華阜康生物科技有限公司，無特定病原體SPF 級別）；菊黃東方鲀精巢（福建省漳州市漳浦縣佛曇鎮）；乳酸、肝糖原、血清尿素氮等試劑盒（南京建成生物工程有限公司）；?；撬幔ò⒗≡噭┯邢薰荆?；生理鹽水（國藥集團），香菇多糖（遠慕生物科技有限公司）

1.2 儀器

HH-6 數顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；酶標儀（TECAN 集團有限公司）；離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；真空冷凍干燥機（德國CHRIST）

1.3 方法

1.3.1菊黃東方鲀精巢醇提物的制備 將菊黃東方鲀進行剖殺，收集精巢組織，清水洗凈，凍干，粉碎保存。用52 °食用酒精，按照料液質量（g）體積（mL）比1∶25、水浴溫度50 ℃的條件提取4.5 h，離心，取上清液，減壓蒸餾濃縮，冷凍干燥得到菊黃東方鲀精巢醇提物（得率約為24.2%）。

1.3.2動物實驗

1.3.2.1動物分組 取60 只小鼠，體質量為（20±2）g，動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。將小鼠隨機分為6 組，包括菊黃東方鲀精巢醇提物飼喂低、中、高劑量組［50、100、200 mg/（kg?d）］、精巢原樣組［100 mg/(kg?d)］、陽性對照組［香菇多糖50 mg/（kg?d）］和空白對照組（生理鹽水），每組10 只小鼠，雌雄各半；分組后25 ℃適應環境飼養7 d，光暗12 h∶12 h 交替；每天灌胃1 次，灌胃劑量見分組。灌胃前小鼠稱重記錄，連續28 d。此實驗期間，小鼠自由攝食及飲水。

1.3.2.2負重游泳實驗 末次給藥30 min 后，將各組小鼠取出，尾部綁定該只小鼠體質量5%的自制負重物；在游泳箱中放入適量水，水深約40 cm，水溫保持（25±1）℃；將要進行實驗的小鼠充分打濕毛發，防止毛發間的空氣對實驗產生影響；將小鼠放入游泳箱游泳。每只水箱一次放入5 只小鼠。如有小鼠趴在游泳箱邊緣部位休息，則用玻璃棒驅離，使其保持運動狀態，記錄小鼠從游泳開始至力竭的時間（以小鼠身體完全沒入水中且持續10 s 后為判斷標準），為小鼠力竭游泳時間。

1.3.2.3血清尿素氮和肝糖原含量的測定 末次給藥30 min 后，將小鼠毛發充分打濕，置于游泳箱中不負重游泳90 min，取出，擦拭掉水，讓小鼠休息60 min；小鼠摘取眼球取血，常溫放置2 h 后，1 575 g 離心10 min 分離血清；解剖小鼠，分離得到小鼠肝臟，生理鹽水漂洗后，吸干水分，精確稱量100 mg，利用尿素氮和肝糖原試劑盒說明書測定血清尿素氮和肝糖原的含量。

1.3.2.4血乳酸含量測定 末次給藥30 min 后，將各組小鼠取出，尾靜脈采血20 μL；在游泳箱中保持25 ℃水溫，不負重游泳10 min，尾靜脈取血20 μL；小鼠休息20 min 后，再次尾靜脈取血20 μL；利用全血乳酸檢測試劑盒說明書分別檢測3 次血中乳酸的含量，計算全血乳酸曲線下面積。公式為：全血乳酸曲線下面積=5 ×（游泳前血乳酸值+3 ×游泳后0 min 血乳酸值+2 × 游泳后休息20 min 的血乳酸值）。

1.3.2.5毒理實驗 采取 GB 15193.3-2014[8]和Zhao 等[9]的方法進行毒理實驗。每組實驗雌雄小鼠各10 只，級別為ICR 級別，分開飼養。適應一周后，小鼠禁食6 h，但飲水不受限制。之后將菊黃東方鲀精巢醇提物按劑量15 g/kg 給小鼠灌胃。小鼠灌胃完成后，觀察其狀態，一共觀察14 d，并解剖小鼠，觀察小鼠內臟[10]。

1.4 數據處理

采用SPSS17.0 軟件對實驗結果進行統計學處理，組間進行多重比較，LSD 和Duncan’s multiple range test 判斷組間樣本的顯著差異；每組小鼠10只，實驗進行3 次重復，取平均值，表示為

2 結果與分析

2.1 菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠體質量的影響

由表1 可以看出，空白組、菊黃東方鲀精巢醇提物高、中、低劑量劑量組、原樣組和陽性組小鼠的體質量隨著時間的延長逐漸增長。灌胃飼養相同時間時，空白組、菊黃東方鲀精巢醇提物低、中、高劑量組、原樣組和陽性組，各組組間小鼠體質量的差異不顯著（P >0.05），說明菊黃東方鲀精巢醇提物飼喂對小鼠的體質量沒有顯著影響（P >0.05）。

表1 菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠體質量的影響Table 1 Effects of AETT on weight of mice g

2.2 菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠負重游泳時間的影響

灌胃菊黃東方鲀精巢醇提物飼養28 d 后，各組小鼠的負重游泳時間如圖1 所示。高劑量組小鼠負重游泳時間為45.35 min，是空白對照組小鼠負重游泳時間的2.24 倍，極顯著地延長了小鼠的負重游泳時間（P <0.01），提示灌胃高劑量AETT 使小鼠體力明顯增加；中、低劑量組和原樣組小鼠負重游泳時間分別是空白組的1.41、1.09 倍和1.23 倍，在一定程度上延長了小鼠負重游泳時間，與空白組無顯著差異（P >0.05）。實驗結果說明菊黃東方鲀精巢醇提物能夠延長小鼠負重游泳的時間，且呈現劑量效應。

圖1 菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠負重游泳時間的影響Fig.1 Effects of AETT on weight-bearing swimming time in mice

2.3 菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠血清乳酸含量的影響

如圖2 所示，喂養28 d 后，各組小鼠無負重游泳1 h 后，高、中劑量組和陽性對照組的血乳酸含量分別比空白組減少了20.0%、12.4%和19.6%，具有顯著差異（P＜0.05），低劑量組和原樣組的血乳酸含量與空白組的血乳酸含量相近。說明經過酒精浸提的菊黃東方鲀精巢產物可以有效地清除或延緩小鼠體內乳酸堆積，隨著劑量的增加，對血乳酸的清除作用逐漸明顯，呈現一定的量效關系。

圖2 菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠血清乳酸含量的影響Fig.2 Effect of AETT on serum lactic acid content in mice

2.4 菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠血清尿素氮含量的影響

各組小鼠喂養28 d 后，血清尿素氮變化情況如圖3 所示。高、中、低劑量組、陽性組和原樣組分別比空白組降低了37.30%、22.0%、13.7%、25.4%和10.1%，高劑量組血清尿素氮含量與空白組比具有極顯著差異（P＜0.01），低劑量組和原樣組則差異不明顯。菊黃東方鲀精巢經醇提取后，在一定劑量范圍內，不同劑量組給藥，能夠減輕血清中尿素氮的含量，且隨著劑量增加，作用越顯著，提示菊黃東方鲀精巢醇提物可以提高腎臟清除尿素氮的能力，具有一定的抗疲勞功效。

圖3 菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠血清尿素氮的影響Fig.3 Effect of AETT on serum urea nitrogen content in mice

2.5 菊黃東方鲀精巢醇提物急性毒理實驗

以15 g/kg 劑量給小鼠灌胃菊黃東方鲀精巢醇提物，并持續觀察14 d，結果見表2。小鼠無死亡現象，體質量變化正常。小鼠的攝食、毛色、大小便、精神狀態等行為活動均未發現異常。小鼠眼、鼻腔、口腔未發現分泌異常物質。觀察后將小鼠進行解剖，肉眼觀察內臟器官未見異常。該結果表明菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠無毒。

表2 菊黃東方鲀精巢醇提物急性毒性試驗觀察記錄Table 2 Observation records of AETT in acute toxicity test

圖4 菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠肝糖原含量的影響Fig.4 Effect of AETT on hepatic glycogen content in mice

3 討論

疲勞是一種復雜的生理生化過程，機體的生理過程會因為運動耐力下降不能維持一定的運動強度。因此，常常采用負重游泳試驗考察小鼠的運動耐力反映機體抗疲勞能力的大小[5]。機體在運動過程中首先會消耗體內的肌酸磷酸（CP）和三磷酸苷（ATP），分解糖原變成苯丙酸，最后變成乳酸，在此期間還會產生ATP，其又可作為能源[11]。而在較長時間的運動后，當機體可利用的糖原耗竭時，機體不能通過糖、脂肪代謝獲得能量時，蛋白質和氨基酸就會進入分解代謝[4]，同時核苷酸的分解代謝也會加強，導致脫氨基生成氨[10]，致使血清中尿素氮含量迅速增加，使得機體對負荷的適應能力變差，肌體就顯示出疲勞的現象[12-13]。大量運動也會使骨骼肌細胞內的主要代謝失去平衡，使機體處于缺氧狀態，也加快糖酵解速度，導致大量的乳酸產生，引起疲勞[10]。運動耐力下降引起運動性疲勞，負重游泳時間的長短是運動耐力的直接體現[14-15]，也可反映抗疲勞的能力。本研究結果顯示，菊黃東方鲀精巢醇提物可增加小鼠力竭游泳時間；Yang等[16]研究表明黑豆籽醇提物能夠延長小鼠的游泳時間，呈現劑量依賴性，具有抗疲勞潛力。

糖與耐力運動的關系非常密切，糖原均會迅速分解產生ATP，維持機體血糖平衡。運動時肌肉會消耗肌糖原，引起血糖降低，工作能力下降，誘發疲勞[17-18]。因此，糖原含量高低是機體運動耐受力的重要標志，可用于測定疲勞程度[19-21]。劇烈運動時，機體相對缺氧，使有氧肌肉活動轉變為無氧代謝，糖酵解加快，乳酸大量堆積，使肌肉中H+濃度升高，pH 值下降，引起機體延遲性酸痛，產生疲勞感覺。因此，血乳酸水平可以反映有氧代謝能力、疲勞的產生和消除速度，也是評價機體有氧代謝能力和疲勞程度的敏感指標[22-23]。尿素氮是蛋白質的代謝產物。當機體長時間運動使正常的能量代謝平衡遭到破壞后，并且隨著機體運動負荷的適應性降低及蛋白質和含氮化合物的分解代謝作用加強，血清尿素氮增加就越明顯[24-25]。血清尿素氮含量的變化也是評價抗疲勞效果的重要指標。當菊黃東方鲀精巢醇提物被吸收進入體內有助于肌糖原的積累，增加肝糖原的儲備量，減少血乳酸和血清尿素氮的產生量，說明菊黃東方鲀精巢醇提物具有增加機體糖原儲備，增強機體對運動負荷耐受能力的功效。這與王勇剛等[12]研究的魚精多肽在抗疲勞方面的作用結果相吻合。Hu 等[26]也證實核桃分心木（Diaphragma juglandis）的醇提物能夠延長小鼠的負重游泳時間，減少血清尿素氮含量，提高乳酸脫氫酶水平和肝糖原含量，具有抗疲勞和抗氧化功效。對于菊黃東方鲀精巢醇提物的使用劑量來說，呈現劑量效正相關趨勢，隨著劑量增加，藥效也跟著明顯。

根據抗疲勞保健食品的功能評價程序和檢驗方法，若1 項以上（含1 項）運動實驗和2 項以上（含2 項）生化指標為陽性，即可判斷該受試物具有抗疲勞作用[21]。菊黃東方鲀精巢醇提物動物試驗中，1 項運動試驗和3 項生化指標的結果為陽性，可以判斷其具有抗疲勞效果。經過急性毒理實驗確認菊黃東方鲀精巢醇提物對小鼠無毒副作用，是安全的。因此，采用河豚魚精巢泡酒開發保健酒具有抗疲勞功效，具有高值化開發應用前景。