基于全基因組Fst和nSL分析鑒別蘇淮豬中性洗滌纖維表觀消化率相關候選基因位點

李開軍，侯黎明，蒲 廣，劉 航，劉根盛，石傳宗，金 通，周 娟，李平華,4,5*，黃瑞華,4*

(1.南京農業大學養豬研究所,南京 210095；2.南京農業大學淮安研究院,淮安 223001；3.淮安市淮陰新淮種豬場,淮安 223322；4.江蘇現代農業(生豬)產業技術體系集成創新中心，南京 210095；5.淮安沐林新農村發展研究有限公司，淮安 223001)

耐粗飼簡單來講是豬對粗纖維含量高、可消化能和營養水平低的日糧耐受，且不影響日增重和飼料轉化率的能力。用化學成分來評價耐粗飼具有明顯優勢，纖維消化率指標則是最佳的單一評價因子。最初，國內外主要使用“粗纖維”評定豬的日糧纖維消化率水平，但由于粗纖維的測定方法不能準確反映日糧中纖維的含量，因此，目前研究人員主要用中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)表觀消化率作為評定飼料中纖維類物質消化指標[1]。

蘇淮豬含有25%淮豬血統和75%大白豬血統，保留了其父本生長快、瘦肉率高的特性及母本的耐粗飼性能。本課題組前期已經對蘇淮豬的耐粗飼性能進行了初步的研究，其中，張葉秋等[2]和郝帥帥等[3]在日糧中使用添加34.8%的米糠替代部分玉米(粗纖維含量7.5%)對蘇淮豬進行75 d飼喂試驗，發現蘇淮豬采食量顯著下降，但其試驗末期體重、試驗期日增重和料肉比無顯著變化，表明蘇淮豬具有耐受高纖維日糧的特性。蒲廣等[4]分別采用基礎日糧和7%、14%、21%、28%脫脂米糠替代玉米的日糧對體重在(62.90±0.78)kg的蘇淮育肥豬進行28 d飼喂試驗，發現對蘇淮豬的生長性能沒有顯著影響，且隨著日糧脫脂米糠等量替代玉米水平的升高，NDF表觀消化率不受顯著影響，進一步驗證了蘇淮豬的耐粗飼性能。

雖然前期已對蘇淮豬的耐粗飼特性進行了研究，但目前還未鑒定到與蘇淮豬耐粗飼相關的宿主基因。推測蘇淮豬群體耐粗飼性狀在長期人工選擇過程中，染色體區段上控制目標性狀基因的優勢等位基因頻率應逐漸增加，多態性發生了改變。因此，本研究擬通過使用選擇信號分析方法來鑒定與蘇淮豬耐粗飼相關的宿主基因。選擇信號分析方法根據其分析原理可以分為以下3種類型：1)基于等位基因頻率譜的方法，代表的計算方法包括Tajima’sD[5]和CLR(composite likelihood ratio)[6]等；2)基于連鎖不平衡的方法，主要包括EHH(extended haplotype homozygosity)[7]和nSL(number of segregating sites by length)[8]等；3)基于群體間遺傳分化的方法，主要包括Fst方法[9]等。目前，應用較為廣泛的選擇信號檢測方法包括Fst和nSL分析方法。目前，利用選擇信號分析來揭示造成表型差異的遺傳機制的相關研究已廣泛開展。例如，張威[10]利用Fst檢測技術，在皖南黑豬中找到與耐粗飼、抗病性、高繁殖力特征相關的基因；Eichstaedt等[11]使用nSL的研究方法，發現了高原人對低壓缺氧的生理適應相關的GPR126和EPAS1基因；Vatsiou等[12]通過研究發現，將nSL與其他選擇信號方法結合起來進行分析，提高了找到受選擇區域的能力。因此，對于受到強烈選擇的個體基因組，基于nSL分析方法[8]可挖掘高纖維表觀消化率蘇淮豬群體的基因組受選擇區域。針對未受到強烈選擇的個體基因組結構與受到選擇的個體基因組結構存在顯著的差異，基于Fst分析方法[9]探究高、低纖維表觀消化率蘇淮豬群體的基因組差異。通過nSL和Fst方法可以初步鑒定與蘇淮豬耐粗飼性能相關的基因，對揭示蘇淮豬耐粗飼的遺傳機制具有重要意義。

本研究利用高、低NDF表觀消化率蘇淮豬的全基因組SNP芯片數據，基于Fst和nSL分析方法，檢測其基因組上的選擇信號，運用功能注釋與富集分析篩選受到選擇的且與蘇淮豬耐粗飼性狀相關的候選基因；通過關聯分析鑒定與蘇淮豬NDF表觀消化率顯著關聯的SNP位點；旨在為蘇淮豬耐粗飼選育及品種改良提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗采樣在江蘇省淮安市淮陰種豬場進行，選取331頭160日齡相同飼養管理條件下健康的蘇淮豬(含25%淮豬和75%大白豬血統的國家級新品種)個體為研究對象(其中包括295頭母豬和36頭公豬)。在試驗期間，所有豬限飼，每天08：00和15：00對豬進行飼喂，自由飲水。采集蘇淮豬的糞便和耳組織樣品，糞便樣品用于NDF表觀消化率的測定，耳組織樣品用于個體基因組DNA的提取。本研究所涉及到的試驗均嚴格按照南京農業大學實驗動物福利與倫理委員會制定的規章制度執行(許可證書編號：SYXK(蘇)2017-0007)。160日齡蘇淮豬的日糧成分見表1。

表1 試驗日糧成分組成Table 1 Ingredient composition of the experimental diet %

1.2 試驗方法

1.2.1 NDF表觀消化率的測定 按每200 g糞樣加15 mL的10%硫酸均勻混合于自封袋中，并且排盡空氣，保存在-20 ℃冰箱待測。其中，NDF含量采用ANKOM A200i半自動纖維分析儀(Ankom，USA)測定[4]，NDF表觀消化率的計算方法參考Niu等[13]和Pu等[14]研究中的公式。

1.2.2 根據NDFEBV挑選試驗群體 使用DMU軟件計算331頭蘇淮豬NDF表觀消化率的EBV[15]，具體模型：Y=μ+H+y+B+A+e，式中，Y代表NDF表觀消化率表型的觀測值；μ代表群體均值；H代表欄舍的固定效應；y代表年份的固定效應；B代表蘇淮豬的采樣批次，由于批次數量較多，作為協變量；A為個體的加性遺傳效應；e為隨機殘差效應。由于試驗群體中絕大部分個體為母豬，且通過回歸分析發現，性別對NDF表觀消化率沒有顯著影響，故在模型中沒有考慮性別因素。

根據NDFEBV將331頭蘇淮豬按照從大到小進行排序，挑選高(n=33)、低(n=33)各10%的蘇淮豬用于后續的芯片分型和選擇信號分析。

1.2.3 高、低NDF表觀消化率蘇淮豬基因型檢測 利用組織基因組提取試劑盒(天根)提取耳組織樣品基因組DNA，DNA質檢合格后，使用基于Illumina平臺的Geneseek公司開發的GGP 80K SNP芯片進行檢測，獲得SNP分型數據。原始基因型數據以ped和map文件存儲?？紤]到原始基因型數據等位基因頻率偏低可能影響后續的分析結果，因此，利用PLINK軟件對SNP進行質量控制[16]。質控標準：平均檢出率大于0.9，平均最小等位基因頻率大于0.01，個體檢出率大于0.9。

1.2.4 基因型數據填充 由于nSL分析需要全部分型成功的SNP基因型，本研究將芯片數據質控后沒有分型成功的SNP位點進行填充，利用Beagle軟件對有缺失的基因型數據進行填充和單倍型推斷[17]。

1.2.5 高、低NDF表觀消化率蘇淮豬群體間Fst選擇信號檢測 按照Weir和Cockerham[18]的統計方法進行高、低NDF表觀消化率蘇淮豬群體間Fst值的計算，利用Vcftools軟件計算每個位點的Fst值[19]。利用R包qqman展示全基因組水平上Fst值的分布[20]。選擇Fst值top 1%作為閾值線[21]，高于閾值線的SNP位點定義為受選擇位點。Fst的計算公式參考Weir和Cockerham[18]的報道。

1.2.6 高NDF表觀消化率蘇淮豬群體內nSL選擇信號分析nSL選擇信號的計算使用Selscan軟件[22]進行，將高NDF表觀消化率的蘇淮豬群體作為試驗群體?；趎SL選擇信號得到的統計量近似符合正態分布[8]，因此,對計算得到的原始nSL值，利用norm參數進行標準化正態分布處理。將標準正態化處理后的nSL取絕對值，同時從大到小排序，取top 1%作為閾值線[21]，高于閾值線的SNP位點定義為受選擇位點。nSL的計算原理參考Ferrer-Admetlla等[8]的報道。

1.2.7 蘇淮豬顯著選擇信號候選區域功能注釋 分別將高、低NDF表觀消化率蘇淮豬群體間Fst分析和高NDF表觀消化率蘇淮豬群體nSL分析中鑒別的距離小于250 kb的受選擇位點合并成一個顯著選擇信號區域，以此類推[23]。對選擇信號區域內的基因進行基因注釋，使用豬11.1版本參考基因組(Sscrofa 11.1)，注釋網站為Ensembl官網(http://www.ensembl.org)。除了對豬相關基因注釋數據庫分析外，將找到的候選基因通過Ensembl網站的Biomart數據庫同人基因組進行同源比對，獲得人方面相對應的直系同源基因集，并結合Genecards數據庫[24]和NCBI中的PubMed數據庫來挖掘基因功能注釋信息。通過KOBAS 3.0數據庫(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/)對受選擇區域內的基因進行GO和KEGG功能富集分析[25]，分析內容涵蓋了細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物學過程(biological process)以及生物學通路(pathway)分析。

1.2.8 蘇淮豬全群NDF表觀消化率與基因型的關聯性分析 挑選Fst和nSL兩種分析中受到選擇的共有SNP位點，通過一代測序進行全群分型。利用SAS 9.4軟件將共有SNP位點基因型與NDF表觀消化率進行關聯性分析，具體模型：Yijkm=μ+Gi+Hj+yk+Bm+a+eijkm，式中，Yijkm為豬的NDF表觀消化率；μ為均值；Gi為豬的基因型固定效應；Hj為欄舍的固定效應；yk為年份的固定效應；Bm代表蘇淮豬的采樣批次，由于批次數量較多，作為協變量；a為去除SNP效應的個體育種值；eijkm為隨機殘差效應。以P<0.05表示差異達到顯著水平，以P<0.01表示差異達到極顯著水平。由于試驗群體中絕大部分個體為母豬，且通過回歸分析發現，性別對NDF表觀消化率沒有顯著影響，因此在模型中沒有考慮性別因素，所得結果均以NDF表觀消化率的“平均數±標準誤”表示。

2 結 果

2.1 蘇淮豬品種內纖維表觀消化率的變異分析

由表2可知，蘇淮豬高、低NDF表觀消化率組在NDF表觀消化率表型上存在極顯著差異(P<0.01)。

表2 高、低組之間NDF表觀消化率的比較Table 2 Comparison of apparent NDF digestibility between high and low groups

2.2 Fst全基因組選擇信號檢測

通過對高、低NDF表觀消化率蘇淮豬群體芯片分型數據進行質控，共有51 367個有效SNPs位點用于后續分析。通過Fst分析高、低NDF表觀消化率蘇淮豬群體間差異的基因組片段，共鑒別到514個受選擇位點，主要分布在1、2、4、5、9、10、11、15號染色體上，其中2號染色體上的受選擇位點分布最多(圖1)。通過合并同一染色體上距離小于250 kb的受選擇位點為一個顯著選擇信號區域，共發現79個顯著選擇信號區域。

閾值線代表Fst值的top 1%The threshold line represent top 1% of Fst圖1 高、低NDF表觀消化率蘇淮豬全基因組水平上的Fst分布Fig.1 Genome-wide Fst distribution of Suhuai pig populations with high and low apparent NDF digestibility

2.3 高NDF表觀消化率蘇淮豬群體內nSL分析

通過nSL方法分析高NDF表觀消化率蘇淮豬受到選擇的基因組片段，主要計算每個核心SNP的檢驗統計量，并取其絕對值，包含有47 972個nSL統計量，共鑒別到480個受選擇位點，主要分布在1、2、3、4、5、6、7、10、12、14號染色體上，其中7號染色體上的受選擇位點分布最多(圖2)。通過合并同一染色體上距離小于250 kb的受選擇位點為一個顯著選擇信號區域，共發現76個顯著選擇信號區域。

閾值線代表nSL值的top 1%The threshold line represent top 1% of nSL 圖2 高NDF表觀消化率蘇淮豬群體全基因組水平上的nSL分析Fig.2 Genome-wide nSL distribution of Suhuai pig population with high apparent NDF digestibility

2.4 蘇淮豬顯著選擇信號區域候選基因富集分析

通過使用Fst和nSL分析方法，共鑒定到146個受選擇信號區域(其中兩種分析方法部分受選擇信號區域發生重疊)。利用Ensembl數據庫的BioMart 模塊注釋Fst和nSL分析方法分別獲得的選擇信號區域富集的基因，并與人類基因組進行直系同源比對，共獲得361個人類直系同源基因。富集分析結果發現，部分條目的生物學功能與豬的腸道細胞增殖和腸道免疫功能相關。例如，有8個基因被富集到“MAPK信號通路”，而“MAPK信號通路”是已發現的與結腸健康有關的通路，而結腸是消化纖維的關鍵部位(表3)。

表3 基因富集分析結果Table 3 The result of terms revealed by enrichment analyses

選擇信號區域內基因功能注釋發現，多個基因與腸道發育、健康、細胞增殖等生物學功能相關，包括MTHFD1L、PHLPP1、TRPM6、MCC、NEDD9、UVRAG、KLF5等基因，這些基因可能影響腸道纖維消化(表4)。

表4 選擇信號區域內與NDF表觀消化率相關的重要候選基因Table 4 The candidate genes related to apparent NDF digestibility in the selected signal regions

2.5 NDF表觀消化率與SNP基因型的關聯性分析

在Fst、nSL兩種分析鑒別的受選擇位點中，有8個相同的位點，分別位于1、2、6、8和12號染色體(表5)。通過蘇淮豬全群NDF表觀消化率與8個SNPs位點關聯分析發現(表5)，rs81363074、rs327393763和rs81404927位點與蘇淮豬群體NDF表觀消化率存在顯著關聯(P<0.05)，rs81347101和rs318870857位點與蘇淮豬群體NDF表觀消化率存在極顯著關聯(P<0.01)。其中，對于rs81347101位點而言，GG基因型個體的NDF表觀消化率極顯著高于AA基因型個體(P<0.01)，AG基因型個體的NDF表觀消化率顯著高于AA型個體(P<0.05)。而rs80917848、rs81432855和rs81270042位點與NDF表觀消化率不存在顯著關聯(P>0.05)。

表5 SNPs基因型與NDF表觀消化率的關聯性分析Table 5 Association analysis of genotype at various SNPs with apparent NDF digestibility

3 討 論

3.1 中國地方豬耐粗飼研究進展

已有大量文獻報道不同豬種利用纖維的能力有差異，例如中國的地方豬種[33-34]被發現與現代高度商業化的瘦肉型豬種相比均表現出更強的粗纖維消化能力。過去中國地方品種豬主要采用放牧形式或以青粗飼料為主、添加精料為輔的低營養水平的日糧作為飼料，因此，普遍具有耐粗飼特性?；糍F成[35]報道指出，以稻殼和米糠作為日糧主要纖維源，隨著日糧中NDF含量的提高，胃腸道形態上發生明顯的適應性變化，即消化道長度增加，尤其結腸長度增加明顯；付金劍等[36]研究發現，14%麩皮替代日糧水平可抑制二花臉豬結腸細胞的凋亡，維持腸道健康。這些都說明了中國地方豬的耐粗飼特性，但是，關于中國地方豬耐粗飼能力的遺傳機制尚不清楚。因此，本試驗以蘇淮豬為研究對象，探索豬耐粗飼能力的相關遺傳機制。

蘇淮豬含有耐粗飼性能強的淮豬的25%血統，在培育過程中對耐粗飼性能進行了持續的人工選擇，因此，蘇淮豬具有耐粗飼特性。前期，本課題組張葉秋等[2-4]先后通過蘇淮豬的飼喂試驗和相關生長指標的測定證明了蘇淮豬具有較好的纖維表觀消化率及耐粗飼特性，有利于蘇淮豬對纖維的分解與利用。但目前其受選擇的與高纖維表觀消化率相關的基因或與耐粗飼相關的基因未知。本研究采用高、低NDF表觀消化率的蘇淮豬作為試驗群體，通過使用Fst和nSL的方法來探究蘇淮豬在基因組水平受到強烈選擇的基因片段。

在豬育種早期的時候，根據性狀表型值的高低來選擇相對應的個體。隨著數量遺傳學理論的發展，育種學家借助一定的統計方法將性狀的表型值進行剖分，并從中估計出可以真實遺傳的部分，即育種值，使豬的育種由表型值選擇發展為育種值選擇，從而提高了選種的準確性和效率。尤其是動物模型BLUP方法的應用，使得育種值的估計可以充分利用不同親屬的信息，在對場、年度及其他環境效應進行估計的同時，預測出個體的育種值，從而科學、準確地進行選種[37-38]。因此，本研究采用EBV來選擇試驗對象進行后續的研究。通過研究發現，高、低EBV組蘇淮豬的NDF表觀消化率存在極顯著差異，這進一步說明了本研究樣品選擇的準確性。

3.2 蘇淮豬人工選擇作用

在蘇淮豬品種形成的過程中存在持續的人工選擇，并且由于選擇會在基因組上形成選擇性清除區域。通過檢測識別選擇信號，找到影響蘇淮豬持續受選擇的優良性狀背后的候選基因，如影響耐粗飼及腸道纖維消化能力的候選基因，為相關區域基因的功能研究提供重要參考。

本研究基于豬高密度SNP芯片數據，運用兩種選擇信號分析方法對蘇淮豬進行全基因組檢測，研究發現，共有146個基因組區段受到了強烈的正向選擇作用，區間內共有361個基因。通過富集分析和基因功能注釋分析發現，MTHFD1L、PHLPP1、TRPM6、MCC、NEDD9、UVRAG、KLF5等基因與蘇淮豬的腸道發育和腸道健康相關。Agarwal等[26]研究發現，MTHFD1L基因參與了結腸癌的進展，而MTHFD1L的阻斷降低了結腸癌細胞的生長，維持了結腸的生理健康；Li等[27]研究發現，PHLPP1基因會抑制腫瘤的進展，可降低結腸癌細胞的運動性并阻止腫瘤的進展；Luongo等[28]研究發現，TRPM6不能被TRPM7替代，并且TRPM6/7復合物和TRPM6/7介導的Mg2+流入在人上皮結腸細胞中是必不可少的，影響結腸細胞的增殖和遷移；Benthani等[29]研究發現，MCC基因是結、直腸腫瘤抑制基因，該基因在大腸癌細胞中通過E-鈣黏著蛋白介導的細胞黏附來調節對腫瘤的抑制；Han等[30]研究發現，丁酸鈉可通過miR-203/NEDD9級聯反應誘導結直腸癌(CRC)細胞凋亡，抑制CRC細胞增殖；Quach等[31]研究發現，UVRAG基因是體內至關重要的自噬調節劑，促進自噬可能有助于治療易感人群的炎癥性腸道疾病和癌癥；Nandan等[32]研究發現，成年小鼠結腸組織皮損傷，結腸中的KLF5基因缺失，腸道組織經歷了急性生理變化，進一步表明KLF5基因在結腸穩態中的重要性。因為腸道纖維消化能力與腸道(尤其是大腸)的健康與生長發育緊密相關，所以，這些基因可能通過影響豬的大腸健康、穩態和發育，從而間接影響蘇淮豬的腸道纖維消化能力。因此，這些基因可以作為影響蘇淮豬耐粗飼性狀的候選基因進行后續的研究。

本研究發現，Fst與nSL方法檢測到的選擇信號區域重疊較少，區域內只找到8個共有SNPs位點。其主要原因可能是兩種方法分析的原理不同，且對不同類型的選擇信號具有不同的檢測靈敏度；Fst方法對兩個存在顯著分化的群體選擇信號具有較高的檢測效力，而nSL方法則對短期或正在進行選擇的群體選擇信號具有較高的檢測效力。通過在蘇淮豬全群內，將蘇淮豬的NDF表觀消化率與兩種分析鑒別的8個共有SNPs位點基因型進行關聯分析，來驗證影響蘇淮豬NDF表觀消化率的SNP位點。結果表明，rs81363074、rs327393763、rs81404927、rs81347101和rs318870857位點與蘇淮豬群體NDF表觀消化率存在顯著關聯，而這5個位點也可以用于蘇淮豬纖維消化率選育提升的分子標記。其中，rs81363074位點位于在MCC基因上，而MCC是影響結直腸道健康的重要候選基因[29]，因此推測，MCC基因是影響蘇淮豬纖維表觀消化率的重要候選基因，可用于后續的研究。rs327393763位點位于LRP8基因附近，該基因與ABGL4、PCSK9基因相互作用，增加心代謝的風險[39]；rs81404927位點位于DMP1、DSPP、SPARCL1基因上，DMP1基因在成骨細胞分化中起作用[40]，DSPP基因與牙本質發育有關[41]，SPARCL1基因在中樞神經系統發育中起著關鍵作用[42]；rs81347101位點位于DHCR24基因上，該基因突變影響膽固醇的產生[43]；rs318870857位點位于GLIS1基因上，該基因調控細胞的分化與表達[44]。然而，上述rs327393763、rs81404927、rs81347101和rs318870857位點及其所在基因是如何影響纖維消化的有待后續進一步研究。

4 結 論

本研究使用Fst與nSL兩種互補的檢測方法在高、低NDF表觀消化率蘇淮豬群體中找到146個受選擇的基因區域，并依此鑒定到影響蘇淮豬NDF表觀消化率的受選擇候選基因MTHFD1L、PHLPP1、TRPM6、MCC、NEDD9、UVRAG、KLF5。同時還鑒定到rs81363074、rs327393763、rs81404927、rs81347101和rs318870857位點與NDF表觀消化率相關聯。上述基因和分子標記的發現為未來解析蘇淮豬耐粗飼性狀的遺傳機制提供了重要參考依據。