一種GLP-1過表達腸類器官構建的方法

曾之揚，陸佳微，曹希雅，王芯悅，李大力

技術與方法

一種GLP-1過表達腸類器官構建的方法

曾之揚1，陸佳微1，曹希雅1，王芯悅2,3，李大力1

1. 華東師范大學生命科學學院，上海市調控生物學重點實驗室，上海 200241 2. 安徽理工大學醫學院，淮南 232000 3. 上海交通大學附屬第六人民醫院南院消化內科，上海 201499

胰高血糖素樣肽1 (glucagon-like peptide 1, GLP-1)作為一種腸促胰島素，主要由腸道L細胞分泌，由于其能夠有效促進胰島素的釋放從而降低血糖，因此GLP-1及其類似物在2型糖尿病的治療上具有良好的應用前景。本研究優化了慢病毒感染類器官的方法，利用該方法成功構建了GLP-1過表達的小鼠小腸類器官(organoids)。結果顯示該類器官分泌的GLP-1能夠有效地提高野生型及糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力。因此，本研究構建的GLP-1過表達類器官可以為2型糖尿病的治療提供一種新的策略。

胰高血糖素樣肽1；2型糖尿??；小腸類器官

胰島素分泌障礙是2型糖尿病的標志。2型糖尿病治療策略之一是基于腸道內分泌型L細胞產生的胰高血糖素樣肽1 (glucagon-like peptide 1, GLP-1)的降血糖作用，GLP-1具有促進胰島素的釋放，提高胰島β細胞增殖及存活，促進飽腹感等功能[1～3]。GLP-1在機體攝取營養物質時被釋放，隨后被二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4, DPP4)迅速降解，因此其半衰期大約只有1～2 min[4,5]。已有研究表明將人GLP-1與小鼠免疫球蛋白G重鏈恒定區(IgG1heavy chain constant regions)結合形成融合蛋白(GLP-1/Fc)可以有效延長其半衰期，提高生物利用率[6,7]。目前GLP-1/Fc融合蛋白已在糖尿病小鼠模型的治療中被廣泛應用。例如通過肌肉注射GLP-1/Fc過表達質粒能夠促進胰島素產生并提高小鼠的糖耐受能力[7]。此外，通過光控誘導HEK293T細胞表達GLP-1/Fc可以有效減輕2型糖尿病小鼠的血糖損傷[8,9]。然而以上的研究均未能實現GLP-1/Fc長期及原位表達，因此通過構建GLP-1/Fc過表達的小腸類器官并將其原位移植到小鼠小腸中可能是一種有效治療2型糖尿病的方法。

小腸類器官是指將小腸隱窩或干細胞在體外培養形成具有腸干細胞及各種終末分化細胞的類似于花環狀的囊狀細胞團，因其能在體外模擬體內小腸的自我更新，因此又可以被稱為迷你器官[10]。這種迷你器官的培養體系最早是由Sato等[11,12]在2009年構建，除了含有Lgr5+腸干細胞，類器官還包含有Lysozyme+潘氏細胞，Muc2+杯狀細胞，Chromogranin A+腸內分泌型細胞等終末分化細胞。最新的研究表明體外培養的人腸及小鼠腸類器官中均含有能表達GLP-1的L細胞[13～16]，這說明腸類器官幾乎包含著所有腸上皮的分化細胞類型，因而具有重建器官的潛能。研究人員進一步將體外培養的類器官原位移植到小鼠的腸內后，發現能重新形成基本的隱窩——絨毛結構，并長期穩定存在[17～19]。因此，類器官還可以為再生醫學提供供體細胞或組織來源。

基于以上背景，本研究建立了一種GLP-1/Fc過表達小鼠小腸類器官構建的方法。利用該方法構建的GLP-1/Fc過表達類器官能夠高效表達活性GLP-1/Fc，通過腹腔注射該活性GLP-1/Fc能有效提高野生型及糖尿病小鼠的糖耐受能力。隨后本研究初步驗證了小腸類器官原位移植的可能性，為2型糖尿病提供一種潛在的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用野生型C57BL/6J小鼠均來源于華東師范大學實驗動物中心，糖尿病(db/db)小鼠(C57BL/6J背景)購自上海實驗動物中心，所有的小鼠均飼養于華東師范大學SPF級實驗動物中心。所有涉及小鼠和實驗方案的程序均符合上海市實驗動物護理評估與認證協會起草的規定，并經華東師范大學實驗動物倫理委員會批準。HEK293T購買于美國ATCC公司。

1.2 過表達載體的構建

實驗所用過表達載體為pLenti-CMV-IRES2- ZsGreen，購于美國Addgene公司。GLP-1/Fc片段(約900 bp)由華東師范大學葉海峰研究員惠贈。設計擴增GLP-1/Fc的PCR引物，并分別在正向引物及反向引物中添加I和I酶切位點和相應保護堿基序列。PCR擴增GLP-1/Fc片段后膠回收約900 bp的DNA片段，然后同時用I和I酶分別酶切pIRES2-ZsGreen載體及GLP-1/Fc回收產物，隨后再次膠回收酶切過后的載體及PCR片段。接著用T4 DNA連接酶連接酶切過后的載體和片段，在16℃中連接過夜，連接產物轉化到感受態細胞中，隨后涂板，挑取單克隆，培養過夜后提取質粒，通過一代測序驗證得到pLenti-CMV-GLP-1/Fc-IRES2- ZsGreen質粒。慢病毒包裝所需pMD2.G及psPAX2質粒均由北京大學魏文勝教授惠贈。

1.3 慢病毒的包裝、濃縮及滴度測定

培養20皿HEK293T細胞，待細胞長至70%～ 80%密度時進行轉染。將pLenti-CMV-GLP-1/Fc- IRES2-ZsGreen、pMD2.G和psPAX2質粒各10 μg與90 μL的PEI充分混勻，DMEM補足到1 mL，渦旋震蕩后室溫放置20 min，隨后均勻的加入到細胞中。轉染8 h后更換培養基，次日補充適量培養基并在熒光顯微鏡下觀察細胞狀態及轉染效率。轉染48 h后再次補充適量培養基，72 h后收集上清，3500 r/min離心10 min，上清用0.45 μm細胞濾器過濾，濾液置于4℃冰箱暫時保存。病毒濾液轉移至貝克曼離心管中，4℃、25,000 r/min離心3 h。離心過后看到離心管底部出現半透明的病毒顆粒沉淀，棄上清，用1 mL的類器官培養基重懸病毒沉淀得到病毒原液，病毒收集后分裝置于–80℃冰箱保存，避免反復凍融。在24孔板中接種105個HEK293T細胞，待細胞長至 70%密度時用病毒進行感染。取10 μL病毒原液制備10倍連續梯度稀釋的病毒液，然后往每個孔中加入稀釋后的病毒液10 μL，即從高往低分別加入1 μL～10–6μL的病毒，加完稍微混勻，感染48～72 h后，流式細胞儀分析GFP陽性的細胞，選取感染率為1%～10%之間的數據及其對應所加的病毒量，然后根據公式：病毒滴度=103×N×P/V IU/mL (N代表感染時候的細胞量，P代表陽性細胞的百分比，V代表加到每個孔中的病毒量)計算病毒滴度。

1.4 小腸類器官的培養、傳代、凍存與復蘇

取6～8周大的小鼠小腸約10 cm，縱向剪開，預冷的PBS洗干凈，載玻片輕輕地將小腸表面的絨毛刮去，將絨毛去除的小腸置于50 mL離心管中，放在冰盒中短暫保存。將冰盒轉移至安全柜中，用含抗生素的PBS清洗小腸5～8次，將小腸轉移至25 mL含 2.5 mmol/L的EDTA溶液中，4℃搖床中消化20 min。棄EDTA溶液，將小腸轉移至新的50 mL離心管中，加25 mL含抗生素的PBS ，輕晃20～30次，懸液用70 μm的細胞過濾器過濾，重復上述步驟，將兩次過濾后的懸液轉移至同一個50 mL離心管中，4℃、800 r/min離心5 min。棄上清，用2 mL的基礎培養基重懸沉淀，計數。取一定體積的懸液(2000～2500個隱窩)加入到1.5 mL的離心管中，室溫900 r/min離心5 min。用事先在冰上預冷的200 μL基質膠(matrigel, BD)重懸沉淀，隱窩的密度控制在10～15個/μL。接板之前，將96孔板事先在培養箱中預熱30 min，隨后每個孔接種5 μL的隱窩-基質膠混合液，若為24孔板則每孔接種50 μL。將接種好的板于37℃培養箱中放置25～30 min讓基質膠凝固。最后，每孔加100 μL培養基(24孔板加500 μL)，每2～3 d更換一次培養基，5～7 d傳代一次(注：所有的試劑均需添加抗生素以避免染菌，隱窩需盡可能置于冰上以保持活性)。將培養5～7 d的類器官在冰上放置5～10 min。棄上清，加入預冷的1 mL的DMEM，用大槍頭將基質膠打碎，反復吹打30～50次，操作過程中盡量避免產生氣泡。隨后取適量的懸液觀察，若在顯微鏡下能觀察到較多完整的類器官團，則繼續用大槍吹打，直至將類器官吹散為止。將懸液轉移至1.5 mL離心管中，室溫800 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用適量的matrigel重懸。接板過程同上述步驟(注：理論上類器官傳一次可以擴增3～5倍，但由于操作過程中的損失，因此一般只能擴增2～3倍)。

將需要凍存的類器官于冰上放置5～10 min。棄上清，加入預冷的1 mL的DMEM，用大槍頭將基質膠打碎，隨后均勻吹打30～50次左右，此過程應該盡量避免產生氣泡。懸液轉移至15 mL離心管中，用預冷的PBS補足到10 mL，4℃、800 r/min離心5 min。去上清，用1 mL的凍存培養基(Recovery? Cell Culture Freezing Medium，美國Gibco公司)重懸類器官，將重懸液轉移至凍存管中，標記好日期、品系，放入凍存盒中于-80℃冰箱中過夜，隨后轉移至液氮罐中保存。若需要復蘇，將凍存的隱窩取出，置于37℃水浴鍋，快速解凍，隨后將懸液轉移至15 mL離心管中，加入14 mL預冷的基礎培養基，4℃、800 r/min離心5 min。去上清，用適量的預冷基質膠重懸沉淀，然后接板(注：復蘇的過程中加入ROCK抑制劑Y-27632 (Selleck公司，美國)能夠顯著提高類器官的存活率) 。

1.5 類器官培養基的配制

基礎培養基(basal medium)：45 mL的ADMEM (Gibco公司，美國)中加入500 μL的雙抗，終濃度為5 mmol/L的HEPES及谷氨酰胺(Sigma公司，德國)，終濃度為1 mmol/L的N-乙酰半胱氨酸(Sigma公司，德國)，500 μL N2(Invitrogen公司，美國)，1000 μL B27 (Invitrogen公司，美國)，用ADMEM定容至50 mL，配好后用0.22 μm的細胞濾器過濾后分裝置于4℃冰箱備用。

完全培養基(complete medium)：在基礎培養基的基礎上加入終濃度為500 ng/mL的Wnt激動劑R-spondin1 (PeproTech公司，美國)，100 ng/mL的BMP抑制劑Noggin (PeproTech公司，美國)，以及50 ng/mL的表皮生長因子EGF (PeproTech公司，美國)，配制好后用0.22 μm的細胞濾器過濾后置于–20℃冰箱備用。若需要將類器官中的大部分細胞變為干細胞，可以在完全培養基的基礎上加入40 ng/mL WNT配體Wnt3a (PeproTech公司，美國)和5 μmmol/L GSK3β的抑制劑CHIR-99021 (Selleck公司，美國)。

1.6 慢病毒感染小腸類器官

在完全培養基中加入Wnt3a (40 ng/mL)和CHIR-99021 (5 μmmol/L)培養類器官，2～3 d后，類器官大部分變為由干細胞構成的圓形結構。棄上清，加1 mL的DMEM，用大槍頭攪碎基質膠，懸液轉移至1.5 mL離心管，用大槍吹打懸浮液30～50次，直到所有類器官被吹散(可取少許懸液在顯微鏡下觀察)。室溫900 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL的TrypLE? Express (Thermo Fisher公司，美國)重懸沉淀，37℃孵育5 min，鏡檢觀察類器官消化情況，如消化不充分可每次增加2 min的消化時間，直到類器官大部分消化為單細胞為止，隨后加入500 μL的完全培養基終止消化(消化過程中可以加入適量的DNA酶來去除死亡細胞的DNA)。消化完成后，室溫900 r/min離心5 min，棄上清，加入適量濃縮病毒液重懸，然后加入到48孔板中，充分混勻，用封口膜封好，在離心機中以32℃，600×離心1 h，移除封口膜，將類器官在37℃培養箱中孵育6 h (在病毒感染的過程中可以加入8 μg/mL的polybrene (Sigma公司，德國)來提高慢病毒的感染能力，此外也可以添加Y-27632來提高類器官的生存率)。將感染好的類器官轉移至1.5 mL離心管，室溫900 r/min離心5 min，棄上清，冰上放置5 min，加入適量的基質膠，混勻，隨后接板，最后用含有Wnt3a、CHIR-99021和Y-27632的完全培養基培養感染后的類器官，2～3天后將培養基更換為完全培養基。在熒光顯微鏡下觀察類器官的感染效率。

1.7 酶聯免疫吸附實驗(enzyme linked immu-nosorbent assay, ELISA)

接種類器官，待類器官出芽較多時，棄上清，用PBS清洗3次，每次5 min，加入500 μL的PBS，在37℃培養箱中放置6 h，取上清保存于?20℃冰箱用于后續實驗。本研究購買了美國Millipore公司的Glucagon Like Peptide-1 (Active) ELISA Kit并按照其中的說明書來檢測類器官中活性GLP-1的含量。

1.8 腹腔內糖耐受實驗(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)

為了進行腹腔內糖耐受實驗，小鼠需經過16 h的饑餓處理。稱量每只小鼠體重，計算2.5 g/kg體重的葡萄糖劑量，提前配置濃度為250 mg /mL的葡萄糖溶液。通過尾靜脈取血來測定0 min時的血糖濃度，在斷尾之前，將尾巴末端浸入0.25%布比卡因進行局部麻醉，以減輕疼痛。隨后腹腔注射小鼠體重×10 μL的250 mg /mL的葡萄糖溶液和400 μL收集的類器官上清液或者PBS，在葡萄糖注射后的15、30、45、60、75、90、120 min后測量血糖濃度。

1.9 小腸類器官的原位移植

小腸類器官收集到1.5 mL離心管中，基質膠重懸，置于冰上待用。腹腔注射適量的阿佛丁麻醉小鼠，隨后用滅菌膠帶將小鼠固定在塑料板上，剃除小鼠腹部的毛發。用剪刀在小鼠腹部剪開約0.5 cm的口子，用鑷子撐開約1 cm，隨后將小鼠的小腸緩慢拉出擺放在生理鹽水潤濕的紗布上，接著用1 mL注射器吸取約50 μL的類器官懸液，緩慢地將其注射到小腸的腸壁中。將小腸放回到小鼠腹腔中，清理并縫合傷口。最后將小鼠放在37℃的加熱器上直至蘇醒。移植一周后，解剖小鼠，取小腸在熒光顯微鏡下觀測類器官的整合情況。

2 結果與分析

2.1 GLP-1/Fc載體的構建，慢病毒的包裝及驗證

GLP-1/Fc過表達的慢病毒載體構建如圖1A所示，將GLP-1/Fc置于CMV啟動子后，通過IRES2與ZsGreen連接，ZsGreen的熒光強度能夠體現GLP-1/Fc的表達情況。經Sanger測序驗證，pLenti- CMV-GLP-1/Fc-IRES2-ZsGreen質粒構建成功，隨后將該質粒轉染到293T細胞中，48 h后，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光的表達(圖1B)。接著將pLenti- CMV-GLP-1/Fc-IRES2-ZsGreen，pMD2.G和psPAX2質粒共轉到293T細胞中，72 h后收集病毒上清。經檢測，上清中病毒滴度為2.62×106/mL。用該病毒感染293T，發現感染復數(multiplicity of infection, MOI)為100，48 h后也檢測到了綠色熒光的表達(圖1B)。以上結果說明本研究成功構建了具有感染能力的GLP-1/Fc過表達慢病毒，可用于后續類器官的感染實驗。

圖1 GLP-1/Fc慢病毒的包裝及驗證

A：GLP-1/Fc過表達載體構建示意圖；B：GLP-1/Fc過表達質粒感染293T 48 h后Zs-Green表達情況；C：GLP-1/Fc慢病毒感染293T 48 h后Zs-Green表達情況，標尺=200 μm。

2.2 慢病毒感染類器官條件的優化

利用上述GLP-1/Fc慢病毒感染類器官，當MOI為100，48 h后未能檢測到綠色熒光的表達(圖2A)。這提示類器官可能較難被慢病毒感染，因此需要對類器官的感染條件進行優化。通過查閱文獻發現，在培養基中添加polybrene(8 μg/mL)以及在600×離心力的作用下，慢病毒的感染率能顯著提高[20,21]。在上述條件下，MOI為100，再次感染類器官，48 h后依然未能檢測到大量綠色熒光的表達(圖2B)。為此本研究將病毒上清進行濃縮，得到3.28×108/mL的高滴度病毒，隨后用該濃縮病毒感染類器官，MOI分別為200、500、1000、2000，結果顯示MOI為200和500時類器官也不能被有效感染(圖2，C和D)。當MOI提升到1000時，感染48 h后大部分類器官都表達綠色熒光(圖2E)，當將感染復數提高到2000時，類器官全部凋亡(圖2F)。上述結果表明MOI為1000時，慢病毒對類器官的感染效果最佳。

2.3 GLP-1/FC過表達類器官的構建及驗證

利用前文中優化的慢病毒感染體系，本研究成功構建了表達Zs-Green的類器官，在熒光顯微鏡下挑選出綠色熒光表達較強的類器官傳代，經過兩次傳代之后的類器官依然能表達較強的綠色熒光(圖3，A和B)，這一結果證明能夠持續穩定表達GLP-1/Fc- IRES2-ZsGreen的類器官構建成功。為了驗證類器官分泌的GLP-1/Fc是否具有活性，取類器官上清進行ELISA檢測，結果發現GLP-1/Fc過表達類器官產生的上清中活性GLP-1濃度可達180 pmmol/L (圖3C)，相比WT提高了約20倍。

圖2 慢病毒感染類器官條件的優化

A：MOI=100時，病毒上清感染類器官48 h后ZsGreen的表達情況。標尺=200 μm。B～E：優化條件下，MOI=100、200、500、1000時，類器官感染病毒48 h后ZsGreen的表達情況。標尺=100 μm。F：MOI=2000時，類器官基本全部死亡。標尺=100 μm。

圖3 GLP-1/Fc過表達類器官的構建

A：GLP-1/Fc過表達類器官第一次傳代3 d后Zs-Green的表達情況。標尺=200 μm。B：GLP-1/Fc過表達類器官第二次傳代3 d后Zs-Green的表達情況。標尺=100 μm。C：GLP-1/Fc過表達類器官及野生型類器官上清中活性GLP-1濃度。****：<0.0001。

2.4 GLP-1/Fc顯著提升WT和糖尿病小鼠的糖耐受能力

為了進一步驗證過表達類器官分泌的GLP-1/Fc活性，本研究分別用WT和糖尿病小鼠進行了糖耐受實驗。結果發現注射GLP-1/Fc過表達類器官上清的WT小鼠在葡萄糖注射30 min后血糖就能回復到正常水平，而注射PBS的WT小鼠在葡萄糖注射30 min后血糖依然保持在較高水平(圖4A)。與此同時，在糖尿病小鼠的糖耐受實驗當中，過表達類器官分泌的GLP-1/Fc上清也能夠快速地降低血糖(圖4B)。這些結果表明，過表達類器官分泌的GLP-1/Fc具有很強的活性，能夠顯著提高WT和糖尿病小鼠的糖耐受能力。

2.5 類器官原位移植到小腸

為了探索GLP-1/Fc類器官原位移植到小腸從而治療糖尿病的可能性，本研究取GFP小鼠的小腸隱窩，將其在體外培養形成能自發綠色熒光的類器官(圖5A)，隨后通過原位移植的方式將GFP類器官注射到小鼠腸壁中(圖5B)。移植一周后，取移植小鼠的小腸在熒光顯微鏡下觀察，結果顯示GFP類器官成功整合到了受體小鼠的小腸中(圖5C)。以上結果說明通過原位移植GLP-1/Fc類器官治療糖尿病具有一定的可行性。

圖4 GLP-1/Fc在糖耐受實驗中能快速回復WT和糖尿病小鼠血糖平衡

A：WT小鼠的腹腔內糖耐受實驗。=6，其中曲線下面積(area under curve, AUC)GLP-1組為38.57，PBS組為87.17。B：糖尿病小鼠的腹腔內糖耐受實驗。=6，AUC：GLP-1組為116.6，PBS組為177.6。***：<0.001，****：<0.0001。

圖5 GFP類器官原位移植到小鼠小腸

A：GFP小鼠的隱窩在體外培養3 d后形成類器官及綠色熒光表達情況。標尺=100 μm。B：GFP類器官原位移植到小腸示意圖。C：移植7 d后檢測GFP類器官的整合情況。標尺=200 μm。

3 討論

GLP-1主要是由腸道的L細胞分泌，而葡萄糖則是促進L細胞分泌GLP-1的高效刺激物。已經有研究表明腸道L細胞內存在多種可能的葡萄糖感應機制，包括甜味受體的激活[22]，鈉偶聯葡萄糖轉運體(sodium coupled glucose transporters, SGLTs)的電活性改變[23]以及代謝依賴的鉀通道(KATP)的關閉[24,25]等。其中研究的最為清楚的是葡萄糖通過改變L細胞中SGLTs的電活性從而促進GLP-1的釋放。其中，SGLT1是負責小腸刷狀緣頂端葡萄糖吸收的轉運體，通過在每個葡萄糖分子耦合兩個鈉離子后內流實現逆濃度梯度的葡萄糖運輸。在富含碳水化合物或游離糖的膳食或者注射葡萄糖之后，L 細胞內通過SGLT1轉運的葡萄糖增多，而與之偶聯的鈉離子內流則足以驅動細胞膜去極化從而導致GLP-1的釋放[23]。因此，在葡萄糖攝入幾分鐘之內就可以檢測到血漿中GLP-1的升高[26]。GLP-1通過GLP-1受體發揮作用，而GLP-1受體在許多組織中表達，包括胰島、肝臟、平滑肌，以及中樞神經系統等，所以GLP-1可以通過多種途徑降低血糖。

在胰島中，GLP-1與胰島β細胞中的GLP-1受體結合后導致腺苷酸環化酶的激活和cAMP的產生。隨后通過以下幾種機制刺激胰島素分泌：(1)抑制KATP通道，導致細胞膜去極化；(2)提高細胞內鈣離子濃度；(3)促進線粒體ATP合成增加，導致細胞膜的進一步去極化；(4)關閉電壓依賴性鉀離子通道防止胰島β細胞的再次極化；(5)促進胰島β細胞中胰島素儲存顆粒的胞吐[27]。此外，GLP-1還與葡萄糖協同作用，促進胰島素基因轉錄、mRNA穩定和生物合成，從而補充胰島β細胞中胰島素儲備，防止胰島β細胞儲備的耗盡[28]。還有研究報道GLP-1能抑制胰高血糖素的分泌[29]。

除了影響胰島，GLP-1對其他組織也有顯著作用。GLP-1是回腸制動的重要介質，回腸制動是一種反饋回路，當營養物質到達遠端腸道時，抑制胃排空，確保食物離開胃的速度不超過近端小腸的消化吸收能力，從而維持血糖的正常[30]。在大腦中，GLP-1通過激活下丘腦和腦干中的GLP-1受體促進飽腹感，從而減少食物攝入。在肝臟與肌肉中，GLP-1能促進葡萄糖轉變為肝糖原與肌糖原并增強葡萄糖的代謝[27]。

2型糖尿病患者GLP-1分泌不足，這提示GLP-1在這一高發疾病的發病機制中發揮作用，因此GLP-1及其類似物在2型糖尿病的治療中被廣泛應用[31]。但是目前注射或者口服GLP-1相關藥物的治療方式只能暫時將血糖維持在正常水平。通過293T過表達GLP-1的細胞治療方式也存在一定局限性，比如細胞存活周期短，不能原位表達等[7,9]。因此，構建一種GLP-1過表達小鼠小腸類器官可以有效彌補以上不足之處。

本研究首先構建了GLP-1/Fc過表達的慢病毒載體，并包裝了具有感染能力的慢病毒。隨后，優化了慢病毒感染類器官的方法，發現當感染復數為1000時，病毒可以高效地感染類器官。通過WT和糖尿病小鼠的糖耐受實驗發現GLP-1/Fc過表達類器官分泌的活性GLP-1可以顯著提高小鼠的糖耐受能力。最后，本研究還驗證了原位移植類器官到小腸的可行性?？偟膩碚f，本研究為2型糖尿病提供了一種潛在的治療方法。

然而，本研究依然存在部分有待完善的地方。首先，雖然本研究初步驗證了類器官原位移植的可能，但是原位移植多少GLP-1過表達類器官才能起到治療糖尿病的效果還需要進一步的實驗探究。其次，雖然有研究表明GLP-1的降血糖作用是血糖依賴型的[32]，但是GLP-1在體內的持續表達是否會產生副作用也需要進一步的探究，因此可能的解決方案是設計一套血糖響應的GLP-1過表達體系，只有當血糖升高時才啟動GLP-1的表達，反之則GLP-1表達關閉。最后，考慮到腸類器官中就有L細胞及GLP-1的表達[13,14]，此外也已經有研究表明在培養基中加入膽酸或者G蛋白偶聯膽汁酸受體1 (G- protein–coupled bile acid receptor 1)激動劑可以導致類器官中L細胞增多[15]，那么是否能夠通過類似的方法增加糖尿病小鼠體內的L細胞，從而治療糖尿病，這些有意思的想法都值得進一步去探究、求證。

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A method for constructing GLP-1 overexpression intestinal organoids

Zhiyang Zeng1, Jiawei Lu1, Xiya Cao1, Xinyue Wang2,3, Dali Li1

As a potent insulinotrophic hormone , glucagon-like peptide 1 (GLP-1) is mainly secreted by intestinal L cells, which can effectively promote the release of insulin and thus reduce blood glucose. Therefore, GLP-1 and its analogs have a good prospect in the treatment of type 2 diabetes. In this study, we constructed mouse intestinal organoids that overexpress GLP-1 by optimizing the GLP-1 lentivirus infection method. We found that supernatants secreted by the GLP-1 overexpression organoids effectively enhanced glucose tolerance in wild-type and diabetic mouse. Thus, the GLP-1 overexpression organoids built in this study may provide a novel strategy for the treatment of type 2 diabetes.

GLP-1; type 2 diabetes; intestinal organoids

2021-03-01;

2021-04-14

國家重點研發計劃(編號：2019YFA0110802) [Supported by the National Key R&D Program of China (No. 2019YFA0110802)]

曾之揚，博士，博后，研究方向：發育生物學。E-mail: 52161300029@stu.ecnu.edu.cn

李大力，博士，研究員，研究方向：基因編輯。E-mail: dlli@bio.ecnu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-423

2021/5/12 16:42:36

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210511.1319.001.html

(責任編委: 林鑫華)