光學法血小板計數在小紅細胞性貧血患者中的應用

王楠 譚俊青 鐘廣智 黃靜蓉 李冉 黎翠翠

1廣東省第二中醫院檢驗科，廣州 510095；2廣州華銀醫學檢驗中心 510663

血常規是臨床常規檢查項目，血小板計數更是其中一項重要指標。血小板準確計數對臨床診斷和治療疾病具有重要意義［1］。目前臨床實驗室血小板計數普遍采用全自動血細胞分析儀電阻抗法［2］。但其結果易受小紅細胞、異常血小板（比如大血小板、形狀不規則的血小板、血小板聚集）、脂肪乳、紅細胞碎片或白細胞碎片等干擾，影響血小板計數的準確性［3-8］。本實驗的日本SYSMEX XE-5000i全自動血液分析儀除電阻抗法還可用光學法進行血小板計數。本研究以手工法作為金標準，分別用光學法和電阻抗法對EDTA-K2抗凝全血標本進行血小板計數，對3種方法的計數結果進行比較及相關性分析，探討光學法血小板計數在小紅細胞性貧血患者中的應用。

1 資料與方法

1.1 標本來源收集廣東省第二中醫院2019年12月至2020年3月就診小紅細胞性貧血患者的含EDTA-K2抗凝全血標本109份，均獲得患者知情同意。根據平均紅細胞體積（MCV）大小分成3組，其中MCV＜70 fl的標本43份，再按紅細胞分布寬度（RDW）大小進行分組，RDW＜17%為正常組，RDW≥17%為異常組；70 fl≤MCV＜80 fl的標本32份；MCV≥80 fl的標本34份。標本選用無溶血、無脂血、無凝塊含EDTA-K2抗凝全血標本。標本采集時，應避免因采血不暢而導致血小板被破壞，引起血小板計數假性降低。在采集后2 h內完成檢測。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 手工法日本OLYMPUS雙目顯微鏡，牛鮑改良血細胞計數板，瑞氏染液，血小板稀釋液按《全國臨床檢驗操作規程》（第4版）［9］的要求配制。

1.2.2 電阻抗法和光學法日本SYSMEX XE-5000i全自動血液分析儀及其原裝配套的試劑和質控品。

1.3 檢測方法

1.3.1 手工法方法參考《全國臨床檢驗操作規程》（第4版）的血小板計數。先對血液進行上下顛倒混勻10次，取一支試管加入0.38 ml的1%草酸銨溶液，接著用移液槍吸取20 μl血液加入試管震蕩混勻，靜置至溶血后再混勻，制成血小板懸液；然后用微量采血管取一滴血小板懸液進行充池，靜置15 min，當血小板充分下沉后由2名檢驗人員采用雙盲法進行計數，分別計算4個角落和中央共5個中方格，最后根據公式計算結果。每份標本計數2次取其平均值；取一滴血液標本滴于載玻片右端，取另一張載玻片作為推片。推片與載玻片呈45°，推片末端置于血滴左側，緩慢地向后拉，使之與血液接觸，然后向前推片，動作要平穩使血液在載玻片上形成一層均勻的薄血膜，且要求頭尾分明。用手輕扇使血膜快速干燥，然后再用瑞氏染料按照其說明書對血膜進行染色。待玻片干燥后在顯微鏡下觀察排除異常血小板、血小板聚集等現象的標本［9］。

1.3.2 電阻抗法和光學法采用日本SYSMEX XE-5000i全自動血液分析儀，按照儀器操作規程進行質控和標本檢驗。標本檢驗采用模式5（CBC+RET），該方法可在血小板參數同時查看電阻抗法和光學法的數據。

1.4 統計學方法用SPSS Statistics v23 x86軟件對數據進行數據處理與統計分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差（）表示，3種方法血小板計數結果比較，先采用完全隨機設計方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。相關性分析采用Person相關系數進行分析，r＞0.95認為存在顯著性相關，r＞0.80認為高度相關。

2 結 果

2.1 3種方法血小板計數結果比較MCV＜70 fl時，電阻抗法與手工法比較結果較高，差異有統計學意義（P＜0.05），光學法與電阻抗法比較結果較低，差異有統計學意義（P＜0.01），光學法與手工法比較差異無統計學意義（P＞0.05）；70 fl≤MCV＜80 fl和MCV≥80 fl時，電阻抗法和光學法與手工法比較結果差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 小紅細胞性貧血患者全血標本3種方法血小板計數結果比較（×109/L，）

表1 小紅細胞性貧血患者全血標本3種方法血小板計數結果比較（×109/L，）

注：MCV為平均紅細胞體積；與手工法比較，aP＜0.05；與電阻抗法比較，bP＜0.01

MCV MCV＜70 fl 70 fl≤MCV＜80 fl MCV≥80 fl P值0.003 0.731 0.340份數43 32 34手工法315.162±63.765 288.091±73.942 283.762±75.255電阻抗法341.423±92.312a 290.696±102.267 278.213±74.401光學法320.633±77.014b 285.166±82.878 281.712±65.713 F值4.271 0.352 0.973

2.2 3種方法血小板計數結果相關性分析MCV＜70 fl時，電阻抗法與手工法、光學法與手工法及電阻抗法與光學法血小板計數結果的相關系數r分別為0.914、0.921和0.945；70 fl≤MCV＜80 fl時，r分別為0.935、0.943和0.978；MCV≥80 fl時，r分別為0.926、0.888和0.962。見表2。

表2 小紅細胞性貧血患者全血標本3種方法血小板計數結果相關性分析（r值）

2.3 MCV＜70 fl時不同RDW分組3種方法血小板計數結果比較當MCV＜70 fl時，進一步按RDW進行分組，RDW＜17%為正常組，RDW≥17%為異常組。當RDW＜17%時，電阻抗法與手工法結果比較差異有統計學意義（P＜0.05），光學法與手工法比較差異無統計學意義（P＞0.05）；當RDW≥17%時，電阻抗法和光學法與手工法結果比較差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表3。

表3 MCV＜70 fl時不同RDW分組小紅細胞性貧血患者全血標本3種方法血小板計數結果比較（×109/L）

表3 MCV＜70 fl時不同RDW分組小紅細胞性貧血患者全血標本3種方法血小板計數結果比較（×109/L）

注：MCV為平均紅細胞體積，RDW為紅細胞分布寬度；與手工法比較，aP＜0.05，bP＜0.01

RDW RDW＜17%RDW≥17%P值0.012 0.005份數29 14手工法296.666±63.981 338.142±55.393電阻抗法316.342±86.147a 393.367±85.101b光學法298.863±71.045 365.710±71.033b F值2.939 3.078

3 討 論

隨著醫學技術的提高，人們越來越追求更便捷更準確的檢查方法。目前血小板計數常用的方法有手工法、電阻抗法、光學法、熒光染料結合法和流式細胞術［10-12］。

早期血小板計數采用手工法，對時間有一定要求，要求檢測人員經過嚴格的專業訓練以及豐富的工作經驗，雖容易受主觀因素影響，但其優點也不可忽視［13］。手工法可以排除其他細胞比如小紅細胞、異常血小板比如大血小板，形狀不規則的血小板、脂肪乳、紅細胞碎片或白細胞碎片以及EDTA-K2依賴的血小板聚集對血小板計數的干擾［14］。隨著醫學技術的提高和標本量增加，全自動血液細胞計數儀得到了普遍和廣泛的應用［6］。電阻抗法測血小板是通過阻抗信號來進行細胞分類的，電阻抗信號越小，細胞的直徑就越小，與細胞內容物無關，只與細胞直徑相關。與手工法相比，電阻抗法檢測時間較短，操作更簡便。光學法是通過接收到的前向散射光和側向散射光信號，前者與細胞大小相關，后者與細胞內容物結構相關，然后綜合分析對細胞進行分類。所以光學法與電阻抗法相比，前者可以排除因為紅細胞碎片，小紅細胞引起的血小板計數產生的誤差［4，15-17］。熒光染料結合法是利用熒光染料來計數血小板。熒光染料結合法比光學法測得血小板更多，光學法只能測得成熟的血小板，熒光染料結合法還可以測未成熟血小板。而且熒光染料結合法也可以排除血細胞碎片，小紅細胞、異常血小板對血小板計數的干擾。流式細胞術利用抗原抗體結合來區分血小板與其他細胞，具有較強的特異性，但對于抗體的要求較高，要求抗體能識別所有的血小板，因此對技術和成本要求比較高，不利于在常規篩查中應用［18］。

有研究表明，在血細胞形態正常及無溶血、脂血、血小板凝集的情況下，手工法、電阻抗法、光學法都可以滿足日常檢測的需要［19］。在面對血細胞形態正常的標本時，電阻抗法和光學法都有良好的重復性和準確性，雖然存在不同程度的誤差但在可允許范圍內。但是對于小細胞性貧血患者的標本來說，里面含有的小紅細胞會對電阻抗法血小板計數進行干擾，由于方法學的局限性，電阻抗法會將小紅細胞誤認為是血小板，使血小板假性升高。光學法利用接收到的前向散射光和側向散射光信號從而區分血小板和小紅細胞，可避免出現誤判。所以在面對這一類標本時，在沒有血小板聚集的情況下，光學法要優于電阻抗法［20-22］。

本研究首先以MCV進行分組，發現3組之間血小板計數結果均具有良好的相關性。MCV＜70 fl時，電阻抗法與手工法比較結果偏高，差異有統計學意義（P＜0.05）；電阻抗法與光學法比較結果較高，差異有統計學意義（P＜0.05）；70 fl≤MCV＜80 fl和MCV≥80 fl時，電阻抗法和光學法與手工法結果比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），研究結果與報道相符。因此，對于MCV≥70 fl的標本，臨床常規采用全自動血細胞分析儀電阻抗法進行血小板計數對結果無影響。

對于MCV＜70 fl的標本，手工法鏡檢發現部分血片可見紅細胞大小不均、紅細胞碎片、橢圓形紅細胞、靶形紅細胞等。有研究報道，RDW異常也會對血小板計數造成影響［23-24］。因此，當MCV＜70 fl時，我們進一步以RDW進行分組，RDW＜17%為正常組，RDW≥17%為異常組。當RDW＜17%時，電阻抗法與手工法血小板計數結果比較差異有統計學意義（P＜0.05），光學法與手工法比較差異無統計學意義（P＞0.05）；當RDW≥17%時，電阻抗法和光學法與手工法結果比較差異均有統計學意義（均P＜0.01）。結果提示，當MCV＜70 fl、RDW＜17%時，小紅細胞干擾會導致電阻抗法血小板計數偏高，應采用光學法或手工法復檢；但MCV＜70 fl、RDW≥17%時，小紅細胞大小不均也可影響光學法血小板計數，應采用手工法復檢。

本研究由于樣本量有限，下一步應擴大樣本容量，盡量降低代表性誤差帶來的影響。本研究的目的是探討光學法在小紅細胞性貧血患者中的應用，在面對這一類標本時，光學法要優于電阻抗法。但是在出現MCV＜70 fl且RDW≥17%、血小板直方圖出現異?；蚣毎嫈祪x結果出現提示血小板聚集時建議采用手工法進行血小板計數，必要時可涂片染色鏡檢。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。