1%雞紅細胞懸液4℃保存期限試驗

王蘋 趙明娟 崔鴻博

(北京市懷柔區動物疫病預防控制中心 101400）

1%雞紅細胞懸液是采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗檢測新城疫病毒、禽流感病毒、禽腺病毒Ⅲ群（減蛋綜合征病毒）、傳染性支氣管炎病毒等病原微生物血凝抑制抗體的重要試劑[1]，紅細胞的凝集狀態直接影響試驗結果的判定，不同條件下、不同濃度、不同保存方法都會影響試驗結果的準確性[2-4]。因此，準確配制及合理保存紅細胞懸液是保證試驗結果準確的一項重要環節。在基層實驗室，送檢的每份雞血清樣品一般需檢測新城疫、禽流感病毒H7亞型、禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）、禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）4 種抗體效價，每份水禽血清樣品也需檢測禽流感病毒H7亞型、禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）、禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）3種抗體效價。由于檢測種類多，檢測樣品數量大，不可能一天完成，但如果每次試驗都重新制備1%紅細胞懸液會增加工作量，因此，實驗室檢測人員一般都選擇一次制備足夠一批次檢測試驗所需量的1%紅細胞懸液，于4℃保存，分批次使用。筆者通過試驗觀察1%紅細胞懸液在4℃環境下保存時間對新城疫及禽流感血凝抑制試驗抗原效價的影響，確定了最佳保存時間，僅為廣大基層實驗室檢測人員提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗設計

采用自制1%雞紅細胞懸液，分別測定雞新城疫血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）血凝抑制試驗抗原4 種抗原效價，每種抗原每次試驗設4 個重復，分別記錄1%雞紅細胞懸液在4℃環境下保存1、2、3、4、5、6、7d 時測定的4 種抗原效價，每種抗原用PBS 稀釋后分裝成小份，于-20℃保存，每次試驗取一份檢測其效價。

1.2 試驗儀器設備

12 道多道移液器（5～50μl），單道移液器（5～50μl），一次性吸頭，冷藏柜（4℃）、微量振蕩器、90。一次性微量反應板、一次性加樣槽。

1.3 試驗試劑

新城疫血凝抑制試驗抗原（哈爾濱維科生物技術開發公司，生產批號：20180824），禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗抗原（哈爾濱維科生物技術開發公司，生產批號：2019006），禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）血凝抑制試驗抗原（哈爾濱維科生物技術開發公司，生產批號：2019006），禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）血凝抑制試驗抗原（哈爾濱維科生物技術開發公司，生產批號：2019006），1×PBS緩沖液 (pH7.2～7.4，0.01mol/L)（HyClone，產品有效期至：2020 年8 月），紅細胞保存液（Solarbio，生產批號：20190328），1%雞紅細胞懸液（自制）。

1.4 試驗方法

1.4.1 1%紅細胞懸液制備

（1）于50ml 潔凈的無菌帶蓋離心管中加入約7ml 阿氏液，用5mL 一次性無菌注射器從翅靜脈處采集3～10 周齡SPF 雞(最少兩只) 血約5ml，與阿氏液于離心管中輕輕混合均勻。

（2）加入3～4 倍體積的PBS 混勻，以1800r/min 離 心8min，棄上清液和沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，重復以上過程，反復洗滌3 次(洗凈血漿和白細胞)。

（3）最后吸取1 倍體積(ml) 的紅細胞，加入99 倍體積(ml) 的PBS，均勻混合，分裝于50ml 三角瓶中，4℃保存備用。

1.4.2 血凝（HA）試驗操作步驟

（1）取90。一次性微量反應板，用微量移液器在1～12 孔均加入0.025ml PBS，換吸頭。

（2）吸取0.025ml 病毒懸液加入第1 孔，吹打3～5 次充分混勻。

（3）從第1 孔吸取0.025ml 混勻后的病毒液加入第2 孔，混勻后吸取0.025ml 加入第3 孔，如此進行對倍稀釋至第11孔，從第11 孔吸取0.025ml 棄之，設第12 孔為PBS 對照。

（4）每孔再加入0.025ml PBS。

（5）每孔再加入0.025ml 體積分數為1%雞紅細胞懸液。

（6）震蕩均勻，在室溫20～25℃下靜置約40min，PBS 對照孔的紅細胞呈明顯的紐扣狀沉到孔底時判定結果。

（7）結果判定：將板傾斜，觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數代表一個血凝單位（HAU）。

1.4.3 回歸試驗操作步驟[5]

（1）取90。一次性微量反應板，用微量移液器在1～4 孔均加入0.025ml PBS，換吸頭。

（2）吸取0.025ml 配制好的4HAU 病毒懸液加入第1 孔，吹打3～5 次充分混勻。

（3）從第1 孔吸取0.025ml 混勻后的病毒液加入第2 孔，混勻后吸取0.025ml 加入第3 孔，如此進行對倍稀釋至第4 孔，從第4 孔吸取0.025ml 棄之。

（4）每孔再加入0.025ml 體積分數為1%雞紅細胞懸液。

（5）輕輕均勻，在室溫20～25℃下靜置約40min 后觀察結果。

（6）結果判定：將板傾斜，觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌。第1 孔、第2 孔完全血凝（不流淌）則抗原配制正確，否則應重新測定抗原血凝效價。

2 試驗結果與分析

2.1 試驗結果

測定的效價分別用回歸試驗檢測，顯示結果準確，查看附表。

附表 1%紅細胞懸液在4℃保存1～7d 時血凝試驗檢測抗原效價結果

2.2 結果分析

試驗結果顯示，1%紅細胞懸液在4℃保存第6 天開始出現溶血，靜置后的上清液由無色透明狀出現淺粉紅色，測定各種血凝抑制試驗抗原的效價開始下降。因此，在開展血凝和血凝抑制試驗時，為保證試驗結果準確可靠，1%雞紅細胞懸液在4℃最多可保存5d，過期則不能使用。

3 討論

3.1 紅細胞懸液保存時間

由試驗結果可知，制備好的紅細胞懸液在4℃環境下保存5d 時，測得的抗原效價基本一致，不影響使用效果；第6 天抗原效價開始下降，說明紅細胞懸液開始溶血，濃度開始下降，不能繼續使用。

3.2 影響試驗結果的因素

血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗是新城疫和高致病性禽流感診斷技術之一[6,7]，4 單位病毒配制的準確性、抗原反復凍融次數、稀釋液pH、被檢血清狀態、1%紅細胞懸液配制方法、試驗耗材、儀器設備、環境溫度、檢測人員操作手法等因素都會對試驗結果造成影響[8]，因此，整個試驗的每個環節都應嚴格按照操作標準進行，盡量減少試驗誤差。

3.3 紅細胞懸液配制過程中的注意事項

采集的血液與阿氏液混合時應將血液沿離心管壁緩慢注入，不能直接垂直打入；在洗滌紅細胞過程中，離心機轉速不要超過2000r/min，每次混勻操作動作要輕，避免劇烈震蕩，否則易造成紅細胞的破裂，造成溶血。

3.4 紅細胞懸液保存注意事項

制備好的1%紅細胞懸液于4℃保存時，最好分裝成小份，每份僅供一次試驗使用，避免反復冷藏及回溫，減少紅細胞破裂，延長保存時間。