雙T型通道對物質的電動富集性能研究

龔艷麗，彭 倍，付卓異，翁 璇，姜 海

(電子科技大學機械與電氣工程學院 成都 611731)

生化檢測分析在很多領域起重要作用，如何靈敏快速地針對某些低濃度物質進行定性或定量檢測的需求日益增加?，F有的高精度檢測設備主要為固定的臺式設備，其結構復雜、價格昂貴、需要專業人員操作等特性限制了其使用范圍。隨著微納制造技術的迅猛發展，微流控檢測平臺為檢測系統的小型化及可便攜化發展帶來了發展空間[1-3]。微流控檢測平臺相較于大型檢測系統，具有樣本消耗量小、成本低、芯片即拋即用、分析時間短等更具競爭性的優勢[4]。然而，其在減小體積和樣本量的同時，給檢測的靈敏度帶來了挑戰。為了改善系統的檢測靈敏度，微流控富集技術應運而生。該技術通過對樣本預處理提高待檢成分的濃度，從而提高檢測靈敏度，很快成為微流控領域的研究熱點之一。

當前，微流控富集技術發展呈現多樣化態勢，依據待富集物質是否主動參與到富集動態中，可將這些技術分為被動富集技術和主動富集技術。被動富集技術通常使用特殊通道結構設計、過濾輔助結構或具有特異性的捕獲元來對目標物進行捕獲富集[5-7]，應用這類方法最大的優勢是富集本身不需要外場的干預，但對樣本的物理特性(如目標物的尺寸、剛度、黏彈度等)或免疫特性要足夠了解，針對這些特性設計的通道結構往往較為復雜[8-9]。主動富集技術通常需要外場的干預來實現目標物的富集，典型技術有：基于梯度場建立的速度差異富集技術[10-12]，主要包括等電位聚焦(isoelectric focusing, IEF)、電場梯度聚焦(electric field gradient focusing, EFGF)、溫度梯度聚焦(temperature gradient focusing, TGF)等；基于緩沖介質特性差異實現的邊界堆疊富集技術[13-15]，主要包括掃描堆積(Sweeping)、等速電泳(isotachophoresis, ITP)和場放大樣品堆疊(field amplified sample stacking, FASS)等；介電泳富集技術[16-17]和基于電滲流與電泳合力作用下的電動富集技術。其中，電動富集技術是一種實現相對簡單的富集技術，而基于離子濃差極化(ion concentration polarization, ICP)效應的電動富集是目前效率較高的富集方式，其將微米通道由納米結構串接，而納米通道是具有離子選擇性的，通過合理的電場條件控制，就能在納米通道一側的微米通道內形成特定離子的高效富集。ICP現象自首次被文獻[18]發現以來，已廣泛應用于微流控富集中[19-21]。利用ICP現象的電動富集方式無疑是目前最受歡迎的富集方式之一，但納米工藝的制作還不具備普適性，這是限制其發展的主要因素。

現有的富集方式各自具有自身的適用領域與應用局限，包括需要掌握目標成分的物化特性、需嚴格的微納通道工藝及電極工藝制備條件、需配置特性符合需求的緩沖介質等。而現有的大部分生化檢測對象是具有負電荷屬性的，如何利用微通道中的流體電動特性在簡單的微通道結構中實現電動富集仍然具有較大的研究空間。前期研究表明，在T型微通道內，通過電滲流的誘導可以產生壓力驅動流，實現持續穩定的流體進樣，而優化的雙T型通道結構在實現流體驅動的同時，還具有帶電離子富集的潛能[22-23]；同時液態金屬可以注入微通道中作為微電極用于雙T型微流控通道中，降低微通道中電極制作的難度[24]。本文在此基礎上對雙T型通道內熒光離子和皮質醇適配體的富集特性分別進行了實驗研究，發現了皮質醇適配體的新型富集現象，并以此為基礎實現了皮質醇的熒光檢測。

1 雙T型電動富集結構與原理

雙T型電動富集結構及流體電動控制原理如圖1所示，通道中心由液態金屬提供形狀規則的中心電極，并通過阻擋柱陣列與樣本通道耦合接觸。通道主體由進樣通道(包括兩個進樣分支)、出樣通道(分左右兩側)、過渡腔與富集腔4個部分構成，如圖1a所示，芯片的實際制作模型如圖1b所示，其中的5個圓形區域為芯片設計的打孔位置，O與O’所示孔位為液態金屬注射控制孔位，直徑均為2 000 μm，A、B、C為樣本溶液注入與存儲孔位，直徑均為4 000 μm，芯片呈左右對稱結構。

圖1 芯片參數及控制原理圖

當通道如圖1b所示接入直流電源DC后，流體在富集腔、過渡腔和兩側出樣通道間產生沿著電場方向的電滲流，使得富集腔中心區域形成負壓腔，此時流體可由進樣通道吸入負壓區域形成持續進樣，其流場分布如圖1c所示。該流場分布由微通道中的直流電場和層流場共同控制，其控制方程為：

式中，V表示電勢；E為由電勢差形成的電場強度；ε0為真空中的介電系數；εr為流體的相對介電率；ζ為通道的zeta電勢；μ為流體中的動態粘滯度；u為速度矢量；ρ為流體密度；p為壓強；I為單位矢量；F為由粘滯度引起的流動阻力。其中，速度u為關鍵變量，由上述方程組求得，并根據其分布可得到流體的流場分布。同時，當樣本溶液中目標成分為帶電物質時，其在對流、擴散及電場遷移的共同作用下，會在流體通道中形成速度平衡點，由此形成富集效應。本實驗主要研究負電荷物質在該結構中的電動富集性能。

2 實驗準備及平臺搭建

2.1 試劑準備

實驗以熒光素納(fluorescein sodium salt, SIGMA,F6377, Germany)陰離子染料作為離子類物質代表，用熒光素納和去離子水配制成濃度為7.8×10-8mol/L的樣本溶液1備用。該染料的激發光峰值波長為488 nm，經激發后的發射光峰值波長為518 nm。以皮質醇適配體15-1序列作為本次實驗的DNA類分子物質代表，其序列號為：5’-GGA ATGGAT CCA CAT CCA TGG ATG GGC AAT GCG GGG TGG AGA ATG GTT GCC GCA CTT CGG CTT CAC TGC AGA CTT GAC GAA GCT T-3’[25]。為了觀察皮質醇適配體的富集情況及后續皮質醇檢測，將該序列5端修飾了羧基熒光基團 (6-FAM，6-Carboxyfluorescein)。該熒光基團的激發光峰值波長為494 nm，經激發后的發射光峰值波長為518 nm。將上述修飾過熒光基團的皮質醇適配體用去離子水配置成1 μmol/L的樣本溶液2備用。

2.2 芯片制作與實驗平臺

本結構的芯片制作簡單，且其中心電極由液態金屬電極構成，中心電極通道與樣本運輸通道耦合一體成型[24]。制作時，首先由光刻工藝得到通道陽模，再由PDMS澆注得到具有通道結構的芯片，并將其與玻璃鍵合、成功地注入液態金屬后即可用，如圖2a所示。實驗系統平臺主要包括微流控芯片、芯片控制電源、熒光顯微鏡、顯微鏡電源與熒光控制器及電腦顯示組件，其系統框架與實物平臺如圖2b和2c所示。

圖2 芯片結構與實驗平臺

2.3 實驗流程

將樣本溶液、芯片和實驗平臺準備好后，按如下步驟開展實驗。

1)在左右兩側樣本溶液預留孔位A和B中分別注入4.5 μL去離子水，待液體在整個通道中流通；

2)調節顯微鏡載樣平臺至視場合適，打開熒光，在樣本預留孔位C中注入6 μL樣本溶液，接通芯片電源；

3)觀察實驗，等待數據記錄。

3 實驗結果與分析

3.1 熒光富集實驗

實驗首先研究了樣本溶液1在雙T型通道內的電動富集狀態，分別記錄了當加載電壓為30、60、90 V時的富集過程，記錄時間為5 min，得到的結果如圖3所示。由圖可以看到，該通道結構對熒光陰離子具有明顯的電動富集功能，富集區域主要集中在富集腔內。由熒光強度分布可以看到，在5 min內電壓越高、富集腔內的富集效果越好。

圖3 不同電壓下雙T型通道內熒光離子的富集狀態

前期研究表明，進樣通道中兩分支通道的間距對負電荷離子的富集效果有明顯影響，間距越大，富集效果越好[23]。因此，實驗研究中，將圖1中芯片結構的分支通道間距進行了調整，制作了新的芯片結構，將圖1中的芯片結構定義為結構1，新的芯片結構定義為結構2，并對兩種結構在60 V電壓下的富集過程進行了對比分析，如圖4所示。其中，圖4a顯示了兩種芯片結構及其在5 min內富集過程的對比，圖4b為圖4a中3個時間節點下(1、3、5 min)由熒光強度表征的富集倍率的量化結果(富集倍率定義為富集腔內平均熒光強度I與進樣通道熒光強度I0的比值I/I0)。由圖可以看到，結構2針對熒光離子的富集效果明顯優于結構1，且兩者富集區域均以富集腔為核心。

圖4 兩種芯片結構在60 V電壓下的富集對比

3.2 皮質醇適配體富集實驗

依據上述熒光離子的富集結果，本節針對富集效果更優的結構2展開了皮質醇適配體的電動富集研究。實驗仍以加載電壓為變量，分別記錄了樣本溶液2在電壓為30、60、90 V時的富集過程，記錄時間為10 min，得到的結果如圖5所示。由圖可以看到，該通道對皮質醇適配體的富集效果不同于對熒光離子的富集效果，電壓較低(30 V)時，皮質醇適配體在入口通道與出口通道交匯口處出現了明顯的富集(如圖5a所示)，隨著電壓增加，在通道交匯口的適配體逐漸向過渡腔和富集腔轉移(如圖5b所示)，到90 V時，適配體在富集腔內與液態金屬電極接觸處匯聚(如圖5c所示)，此時，其富集區域與熒光離子在該通道結構中的富集區域一致。定義該結構中的局部熒光較強區域與進樣主通道區域內的熒光強度之比為富集倍率(同樣記為I/I0)，得到不同電壓下通道不同位置處的富集倍率在10 min內隨時間的變化關系如圖5d所示。

圖5 結構2芯片通道中不同電壓下皮質醇適配體的富集效果

分析上述實驗如下：進樣流與出樣流在進樣通道與出樣通道交匯口處首次發生流體交匯，此時進樣流與出樣流各自在通道內的寬度明顯減小，而皮質醇適配體不同于熒光離子，其尺寸在微通道內不可忽略，當電壓較低時，由電滲流誘導的流體流動速度較低，適配體由于通道驟然變窄會出現阻塞現象，由此逐漸在該區域形成了阻塞型富集；當電壓逐漸增大，流體速度也相應增大，流體對適配體的拖拽力增強，更容易使適配體突破該交匯口進入過渡腔內，而當電壓增大到一定值后，適配體基本可以突破過渡區域進入富集腔內形成與離子類物質相似的富集效果。由圖5d可以看到，對于本結構而言，在30 V電壓下通道交匯口形成的阻塞型富集效果明顯優于90 V電壓下富集腔內的富集效果，前者局部熒光強度可在4 min內迅速達到進樣通道中熒光強度的100倍。

由此，本實驗發現了該結構針對尺寸較大的DNA分子基于阻塞與驅動平衡的新型富集方式，即在雙T型通道中，當通道尺寸與驅動電壓相互匹配時，可以實現分子尺度的物質在通道進樣流與出樣流首次交匯口處的快速富集，該區域不與電極接觸，可以避免樣本物質與電極的相互腐蝕和滲透。

3.3 皮質醇熒光檢測實驗

利用上述基于阻塞與驅動平衡的新型富集方式，本節對皮質醇進行了基于熒光猝滅-點亮機制的定性檢測，檢測原理如下：配制3種狀態的樣本溶液，第一種是被熒光基團6-FAM修飾的皮質醇適配體，標記為樣本1；第二種為在第一種溶液的基礎上添加了適量納米片狀結構的二硫化鉬，標記為樣本2；第三種為在第二種溶液的基礎上添加了適量的皮質醇，標記為樣本3。其中，樣本1的濃度達到一定值后，通過特定波長的激光激發可以觀察到與濃度對應強度的熒光；樣本2由于二硫化鉬的加入，其與熒光基團形成了Forster共振能量轉移(FRET)對[26]，使得熒光發生猝滅，因此觀察不到熒光；樣本3則由于皮質醇的加入，其與適配體通過堿基互補配對結合，其結合力遠高于適配體與二硫化鉬基面結合的范德華力，因此，適配體被皮質醇拉離二硫化鉬，熒光被重新釋放。根據3種樣本溶液的熒光激發狀態，即可判斷皮質醇的存在與否，而雙T型通道的富集效應可以加強局部熒光信號顯示，更有利于低濃度皮質醇的檢測。

實驗中，首先配置了100 μL濃度為1 μmol/L的適配體溶液，將其分成兩等份，其中一份標記為樣本1，在第二份溶液中加入超聲剝離好的濃度為5 mg/mL的二硫化鉬水溶液2.5 μL，震蕩混勻10 s，又將其分為兩等份，其中一份標記為樣本2，另一份加入濃度為1 μg/mL的皮質醇溶液2.5 μL，震蕩10 s，標記為樣本3。將上述3份樣本按前述實驗步驟在30 V電壓下依次展開實驗，實驗時間為10 min，得到的結果如圖6所示。由圖6a可以看到，樣本1通過本結構實現了進樣流與出樣流交匯口處的阻塞型富集，在此處可以觀察到明顯的熒光信號；由圖6b可以看到，樣本2在通道中觀察不到明顯的熒光信號，但可以通過熒光顯微鏡自然光視場下看到結合二硫化鉬的樣本在進樣流與出樣流交匯口處發生匯聚，如圖6b右下角所示；由圖6c可以看到，樣本3在進樣流與出樣流交匯口處也能觀察到明顯的熒光信號。這組實驗證明了本通道對3組樣本物質的富集均符合上述新型富集機制。圖6d分別展示了樣本1、樣本2、樣本3在通道交匯口富集區域內由熒光強度表征的富集倍率隨時間的變化關系。由于樣本富集使得局部熒光信號增強，本次實驗通過雙T型電動富集結構觀察到了明顯的熒光猝滅與點亮過程，證明了皮質醇的存在，皮質醇的檢測濃度為0.1 μg/mL。后續工作中，通過各種參數的優化分析，包括結構尺寸的優化、3種溶質參與量的匹配優化、電壓與結構的匹配優化等，該結構具有實現皮質醇更低濃度檢測的潛能。

圖6 皮質醇的熒光檢測實驗

4 結 束 語

本文主要研究了雙T型通道對不同物質的電動富集效應。首先，在微通道內流體電動控制理論研究的基礎上，通過實驗證實了雙T型通道對熒光陰離子的電動富集功能；其次，對兩種不同的結構分別進行了熒光離子富集，發現結構2具有更好的富集效果，由此展開了該結構對皮質醇適配體的電動富集性能研究，發現了一種低電壓驅動下的新型富集現象，其富集區域遠離電極，可以避免目標物質與電極接觸造成的相互污染與滲透；最后，利用這種新型富集現象實現了對濃度為0.1 μg/ml皮質醇的熒光檢測。實驗表明，雙T型通道對離子及分子尺度的負電荷物質均具有富集功能，但各自富集條件及有效的富集區域不同。該電動富集結構為在線微流控富集技術的發展及針對低濃度物質檢測的微流控平臺的發展提供了新的思路。