菜心BcSVP基因mRNA在異源嫁接體中的運輸分析

陶 鵬，趙彥婷，岳智臣，雷娟利，李必元

(浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

嫁接是農業生產中一種常用的農藝技術，也是科學研究中的一種研究手段[1-2]。構建嫁接體是研究植物基因mRNA長距離運輸的常用方法，基于不同物種中的直系同源基因之間的序列差異，可研究mRNA在穗砧中的上下運輸[3]。利用擬南芥花序軸嫁接，通過RT-PCR檢測到GAI的mRNA在穗砧之間進行了運輸[4]。利用蘋果樹嫁接檢測到IAA14基因的mRNA從砧木運輸到接穗中[5]。此外，一些開花基因的mRNA也被證實發生了長距離運輸。前人發現青花菜和擬南芥中AGL24的mRNA可在韌皮部中長距離運輸，在砧木中超表達AGL24，會促進接穗提早開花[6]。SVP基因編碼了一種MADS-box轉錄調控因子，在基因序列上與AGL24基因相似，但在調控開花時間上卻呈現相反功能[7-8]。擬南芥的SVP基因會作用于頂端分生組織并降低赤霉素的生物合成來抑制開花[9]。SVP與AGL24共表達在花發育早期，參與調控花器官的分化[10-11]。而在序列上類似于AGL24的SVP基因的mRNA是否會像AGL24 mRNA通過韌皮部進行長距離運輸還有待揭示，驗證SVP基因mRNA長距離運輸可為深入研究SVPmRNA運輸的分子機制打好基礎。

前期研究顯示，結球甘藍與菜心相互嫁接具有很好的親和力[12]，是研究BcSVP的mRNA在結球甘藍/菜心異源嫁接體中的長距離運輸的前提條件。本研究基于結球甘藍/結球甘藍嫁接的接穗結球甘藍莖尖和菜心實生苗葉片的轉錄組測序數據拼接獲得了結球甘藍BoSVP和菜心BcSVP的編碼區序列和3’UTR序列。利用結球甘藍和菜心SVP的種間差異序列，在異源嫁接體的接穗結球甘藍莖尖的兩個文庫中篩選出了3條來自菜心的SVP基因的mRNA read。同時，比較分析了結球甘藍/結球甘藍嫁接和結球甘藍/菜心嫁接中接穗結球甘藍莖尖中內源BoSVP基因的轉錄表達情況。

1 材料與方法

1.1 結球甘藍/菜心嫁接及轉錄組測序取樣

將結球甘藍G27與49菜心種子播于穴盤中，生長45 d后，將甘藍G27的莖尖分別嫁接到49菜心的花序軸和結球甘藍G27的莖上(對照組)。嫁接后30 d，對結球甘藍/菜心嫁接體的甘藍莖尖(T01和T02)和結球甘藍/結球甘藍嫁接體的結球甘藍莖尖(T03和T04)進行取樣，莖尖的長度約為2 cm，質量大約0.38 g。取樣菜心實生苗的葉片(T05)。由百邁客公司完成RNA提取、轉錄組測序工作。

1.2 菜心和結球甘藍SVP序列拼接

以白菜的BrSVP基因(Bra030228)序列作為參考序列，從菜心實生苗葉片的轉錄組測序數據(T05)中篩選菜心SVP的read，并拼接獲得菜心SVP基因(命名為BcSVP)的編碼序列以及3’UTR序列。再以BcSVP序列為準，找到其在甘藍中的直系同源基因Bo4g149800。參考甘藍Bo4g149800序列，從結球甘藍/結球甘藍嫁接的接穗結球甘藍的莖尖T03的轉錄組測序數據中篩選獲得結球甘藍SVP基因的read，并拼接獲得結球甘藍SVP基因(命名為BoSVP)的編碼序列和3’UTR序列?；贐cSVP和BoSVP的編碼序列，翻譯獲得BcSVP和BoSVP蛋白的氨基酸序列，再使用ExPASy的在線軟件Compute pI/Mw tool(http://web.expasy.org/compute_pi/)預測BcSVP和BoSVP蛋白質的相對分子質量和等電點。

1.3 從砧木菜心運輸到接穗結球甘藍中的BcSVP基因RNA read的識別與鑒定

由于BcSVP和BoSVP基因在3’UTR序列上有更大的差異，本研究在菜心BcSVP的3’UTR上選擇了一段41 nt的序列CF(Caixin forward sequence)及其反向互補序列CR(Caixin reverse sequence)作為檢索序列，使用UltraEdit軟件在異源嫁接的接穗結球甘藍莖尖T01和T02中篩選菜心BcSVP的mRNA長距離運輸的read，并命名為Read1、Read2、……。為進一步驗證從結球甘藍中篩選出來的read是來自于菜心的BcSVP序列，篩選出的read的序列使用ClustalX[13]再次與BcSVP和BoSVP序列進行比對。如果read的序列與BcSVP序列一致，說明菜心的BcSVP的mRNA長距離運輸到了接穗結球甘藍中。

1.4 結球甘藍內源BoSVP基因的轉錄表達分析

使用菜心BcSVP的CF及其反向互補序列CR可以從接穗結球甘藍中篩選到發生長距離運輸的BcSVP的mRNA read。而與CF和CR的相對應的結球甘藍BoSVP的GF(Ganlan forward sequence)和GR(Ganlan reverse sequence)則可用來篩選結球甘藍的BoSVPread。以GF和GR作為檢索序列使用UltraEdit軟件分別在T01、T02、T03和T04中進行篩選BoSVPread數量，可以排除T01和T02中外源菜心BcSVP的read，獲得結球甘藍內源BoSVP基因的read數量。再基于RPKM的計算方法獲得結球甘藍內源BoSVP基因的轉錄表達情況。計算公式為map到GF和GR序列上的read數除以map到基因組上的所有read數(以million為單位)與檢索序列長度(以KB為單位)。使用Excel作圖，其中橫坐標為生物樣品，縱坐標為RPKM。

2 結果與分析

2.1 菜心BcSVP和結球甘藍BoSVP序列拼接及序列比較分析

使用白菜BrSVP基因(Bra030228)編碼序列在公共數據庫Ensembl Plants上檢索，獲得甘藍的Bo4g149800基因序列?；诠矓祿斓陌撞薙VP序列，從菜心葉片文庫T05拼接獲得了菜心BcSVP的編碼序列?；诠矓祿斓母仕{SVP基因序列，從結球甘藍/結球甘藍嫁接的接穗結球甘藍莖尖的文庫T03中拼接獲得了結球甘藍BoSVP的編碼序列。通過序列比對，菜心BcSVP和結球甘藍BoSVP的編碼序列高度相似，僅有8個堿基的差異(圖1)。BcSVP和BoSVP蛋白在等電點和相對分子質量上都極其相近，為一類相對分子質量較小的酸性蛋白(表1)。

表1 菜心與結球甘藍的SVP基因的同源基因、基因定位及其編碼蛋白的等電點和相對分子質量

2.2 菜心BcSVP和結球甘藍BoSVP基因種間差異序列的篩選

將菜心BcSVP和結球甘藍BoSVP的編碼序列進行比對，結果顯示，BcSVP和BoSVP的編碼區均有726個堿基，但兩者之間僅存在著8個堿基的差異(圖1)。而在BcSVP和BoSVP的3’UTR區， 240個堿基之間就有16個差異的堿基(圖2)。相比于編碼區，BcSVP和BoSVP的3’UTR區更適合篩選種間差異序列。為了盡可能避開選擇性加poly(A)尾對篩選異源運輸read的影響，本研究在菜心BcSVP的3’UTR上選擇最靠近終止子的一段長為41nt的序列作為檢測砧木菜心BcSVP的mRNA長距離運輸的檢索序列CF，考慮到測序結果中有正向和反向read，CF的反向互補序列CR也作為檢索序列。同時在結球甘藍BoSVP與CF和CR相對應的位置上選擇一段40 nt的種間差異序列(GF和GR)，將作為分析接穗結球甘藍莖尖的內源BoSVP轉錄本數量的檢索序列。

起始密碼子和終止子分別用下劃線和方框表示。

終止子用方框表示，黑色背景顯示的是檢索序列GF的位置，而灰色背景顯示的是種間差異序列CF的位置。

2.3 菜心BcSVP和甘藍BoSVP基因mRNA運輸的read的識別及驗證

為分析菜心BcSVP基因的mRNA在結球甘藍/菜心嫁接體中的長距離運輸，使用CF和其反向互補序列CR序列在結球甘藍/結球甘藍嫁接體的結球甘藍莖尖T03和T04中進行檢索，結果沒有檢索到來自菜心BcSVP基因的read。而分別以CF和CR在結球甘藍/菜心嫁接體的結球甘藍莖尖T01和T02的轉錄組測序數據中進行檢索。結果顯示，CF在T01和T02中均沒有檢索到菜心的BcSVP基因的read。但使用CR進行檢索，在T01和T02中分別獲得2個(Read1和Read2)和1個read(Read3)(圖3)。Read1和Read2分別位于T01文庫中的34740498和76178478。而Read3則位于T02文庫中的59545522。菜心Read1、Read2和Read3的長度均為150 nt(表2)。

圖3 使用CR序列進行檢索在異源嫁接體的接穗結球甘藍莖尖T01和T02文庫中檢索到的三個潛在的菜心BcSVP read

為了證實在結球甘藍中篩選出的3個read的確來自于菜心的BcSVP基因，本研究將Read1、Read2和Read3與BcSVP和BoSVP序列進行比對(圖4)。Read1、Read2和Read3中分別有149、59和71個堿基位于3’UTR區。序列比對顯示Read1與菜心BcSVP完全一致，Read2和Read3與菜心BcSVP序列相比分別存在著1個和3個堿基的差異(表2)。而Read1、Read2和Read3與結球甘藍BoSVP序列相比分別存在著27、5、7個堿基序列的差異。說明使用CF與CR鑒定出來的運輸read是從砧木菜心中運輸到接穗結球甘藍莖尖中的。

檢索序列CF和CR用黑色背景標記。

表2 從異源嫁接的接穗結球甘藍莖尖的T01和T02文庫中識別的來自菜心BcSVP基因read的相關信息

2.4 結球甘藍內源BoSVP基因在同源嫁接和異源嫁接的接穗結球甘藍莖尖中的表達

為了解同源嫁接和異源嫁接對接穗結球甘藍莖尖中BoSVP基因的表達影響，使用GF和GR序列(來自結球甘藍的BoSVP基因的種間差異序列)分別在異源嫁接和同源嫁接的接穗結球甘藍莖尖(T01和T02；T03和T04)的轉錄組測序的Raw data中進行檢索，結果如表3顯示，GF和GR在T01和T02中檢索到的read數量之和明顯多于在T03和T04中的數量之和。這些數據基于RPKM標準化后，顯示結球甘藍BoSVP在異源嫁接的莖尖T01和T02中的轉錄表達量分別為120.5和127.5，而在同源嫁接的莖尖T03和T04中的轉錄表達量分別為114.5和106.3，異源嫁接的接穗甘藍中的BoSVP表達量略微高于同源嫁接的接穗甘藍中的BoSVP表達量。

表3 不同種間差異序列在文庫中檢索到的數量

3 結論與討論

使用菜心BcSVP中的種間差異序列，在異源嫁接的接穗結球甘藍莖尖T01和T02中檢索到來自菜心的BcSVPread，通過序列比對進一步證明異源嫁接的結球甘藍莖尖T01和T02中識別的3個read來自于砧木菜心。在異源嫁接體的接穗結球甘藍中的莖尖中出現菜心BcSVP的轉錄本read，說明菜心開花調控基因BcSVPmRNA從砧木菜心運輸到了接穗結球甘藍莖尖中。目前已報道多個基因的mRNA可進行長距離運輸并且發揮功能，比如開花啟動基因FT。擬南芥中FTmRNA可以從葉片通過韌皮部運輸到莖尖，以調控光周期植物的開花[14]。青花菜中FVE基因的mRNA可在韌皮部中移動，在砧木中超表達FVE能促進接穗的提前開花[6]。砧木菜心AGL24的mRNA運輸到接穗甘藍的莖尖中[15]。因此，砧木菜心BcSVP的mRNA長距離運輸也可能會調控接穗甘藍的生長發育。

SVP和AGL24在序列上高度相似[7-8]，且兩者mRNA均可長距離運輸，暗示SVP和AGL24的mRNA長距離運輸可能與特定序列或結構相關。最近研究顯示一些基因序列在單鏈mRNA狀態下可形成類似于tRNA的結構，這些mRNA會在韌皮部中富集，并通過嫁接結合處在接穗和砧木之間進行上下運輸[16]。馬鈴薯StBEL5 mRNA可在韌皮部中運輸，其3’UTR決定了其mRNA的穩定性及其運輸到根的能力[17-18]。下一步識別和鑒定SVP基因mRNA運輸的特定序列和結構，對于研究mRNA的長距離運輸分子機制具有重要的意義。