利用PB設計篩選芽孢桿菌GUTU06產水解銀杏黃酮苷的β-葡萄糖苷酶的主要影響因子

楊運 何臘平 黃露 肖虹

摘 要：利用Plackett-Burman（PB）設計對芽孢桿菌GUTU06的固態發酵培養基的主要培養基組分及培養條件進行篩選，旨在提高GUTU06所產β-葡萄糖苷酶的酶活力，并將其應用于水解銀杏黃酮苷為苷元。結果表明蛋白胨和發酵時間為主要影響因子。在PB設計的基礎上，獲得了初步優化的培養條件，優化后β-葡萄糖苷酶的酶活力為0.9914 U/g，較初始培養基提高了3.8倍。本文為β-葡萄糖苷酶實現工業化生產奠定基礎，同時也為酶法水解銀杏黃酮苷的研究提供一定參考依據。

關鍵詞：Plackett-Burman（PB）設計; 主要因子; 芽孢桿菌; β-葡萄糖苷酶 ;銀杏黃酮苷

中圖分類號：TQ925

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2021）02-0080-04

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.02.014

Abstract：The main medium components and culture conditions of the solid fermentation medium of Bacillus sp.GUTU06 were screened by Plackett-Burman （PB） design to improve the enzyme activity of β-glucosidase，which is produced by GUTU06 and applied to hydrolyze ginkgo flavonoid glycosides into aglycones.The results of the experiment determined that peptone and fermentation time were the main influencing factors.On the basis of PB design，the initial optimized culture conditions were obtained.After optimization，the enzyme activity of β-glucosidase was 0.9914 U/g，which was 3.8 times higher than that of the initial medium.This paper lays a foundation for the industrial production of β-glucosidase，and also provides a reference for the study of enzymatic hydrolysis of ginkgo flavonoid glycosides.

Keywords：Plackett-Burman （PB） design; main factor;Bacillus;β-glucosidase; ginkgo flavonoid

銀杏葉（Ginkgo biloba L.）提取物是目前國際上使用較為廣泛的中草藥之一，主要藥效成分是黃酮類化合物[1]。銀杏黃酮占銀杏葉提取物總含量的22%～24%[2-3]，其主要由山奈酚、槲皮素以及異鼠李素等黃酮苷元與葡萄糖等單糖以O-糖苷鍵連接而成。黃酮類化合物在生物體內代謝時，僅有占比很小的苷元型黃酮可以直接被腸道吸收進入血液發揮作用，而占比很大的糖苷型黃酮則無法實現[4-6]。故水解銀杏黃酮為苷元極具現實意義[7]。

目前，水解銀杏黃酮主要有化學法和生物法?；瘜W法又細分為堿法和酸法，由于通過堿法所得的苷元不穩定、易分解，故酸法較堿法應用更為廣泛;生物法即酶法，其較酸法具有條件溫和、穩定性好、活性成分保留完整等優點，故酶法較酸法發展前景更加良好。水解酶的選擇范圍廣泛，因β-葡萄糖苷酶具有水解效果良好、測定方法簡便、應用范圍普遍、理論研究清晰等特點[8-9]，故優先選擇β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶來源廣泛，酵母菌[10]、霉菌[11]、腸道細菌[12]、芽孢桿菌[13]等均可產。

本實驗室前期已從貴州傳統發酵豆制品中篩選產β-葡萄糖苷酶的功能微生物芽孢桿菌GUTU06，此研究計劃通過PB設計篩選該菌主要培養基成分及培養條件，為進一步提高其產β-葡萄糖苷酶的能力奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌GUTU06菌株由本實驗室分離，現已保存在中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC M 201923。

1.1.2 培養基

種子培養基：酵母提取物5 g/L、牛肉膏10 g/L、氯化鈉5 g/L。

1.1.3 種子培養

從菌株GUTUO6活化斜面上挑取2環接種到250 mL錐形瓶中（含150 mL種子培養基），37 ℃，180 r/min培養24 h，制得種子液。

1.1.4 醋酸—醋酸鈉緩沖液配制

準確吸取2.4 mL冰醋酸（冰乙酸）至燒杯，添加適量蒸餾水，再加入4.92 g無水醋酸鈉，溶解，定容至1000 mL，調節pH至4.80±0.01后使用。室溫下存放2個月有效。

1.1.5 1%銀杏黃酮苷溶液

準確稱取1 g銀杏黃酮苷于燒杯中，加0.05 mol/L、pH 4.8醋酸—醋酸鈉緩沖液溶解70 mL，待溶解完全后轉入容量瓶并繼續使用該緩沖液定容至100 mL，最后置于冰箱中備用。

1.1.6 黃豆前處理及黃豆固態發酵后粗酶液的制備

準確稱量高質量黃豆，加入8倍體積的去離子水，常溫浸泡18 h，瀝水后備用。稱50 g濕豆于250 mL三角瓶，添加一定量的碳源、氮源、無機鹽混勻，121 ℃滅菌20 min。冷卻后接種子液搖勻，37 ℃發酵，每12 h搖晃一次。培養結束后取出，于4 ℃冰箱后熟12 h即得豆豉。

稱取10 g后熟后的豆豉，加入20 mL的無菌生理鹽水中，4 ℃條件下浸提24 h，后用打漿機搗碎經12000 r/min離心10 min，上清液即為固態發酵粗酶液。

1.1.7 β-葡萄糖苷酶活力的測定

以銀杏黃酮苷為底物，在測定條件下，將每分鐘水解銀杏黃酮苷產生1 μmol葡萄糖所需酶量定義為1個酶活力單位，用U/g表示。

測定原理：DNS試劑里的3，5-二硝基水楊酸分子中的硝基可被葡萄糖還原成3-胺基-5-硝基水楊酸（呈橙黃色）[14]。吸光值大小體現溶液橙黃色強度，溶液橙黃色強度展現葡萄糖量多少，而葡萄糖量表示酶活力高低，故可通過吸光值大小反映酶活力高低。

葡萄糖標準曲線的繪制：吸取1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于具塞刻度試管中，補水至2 mL，加DNS試劑3 mL，混合后于沸水中煮10 min，冷卻后加水定容至15 mL，于波長540 nm處測吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標，葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線[7]：y=0.4643x-0.0151，R2=0.9961。

酶活力測定方法：取15 mL具塞刻度試管加入底物（含銀杏黃酮苷溶液）1.8 mL，50 ℃預熱3 min，加入粗酶液0.2 mL，50 ℃水浴30 min，加入DNS試劑3 mL，沸水浴10 min，冷卻至室溫，定容至15 mL。以滅活的酶液為空白對照，于波長540 nm處測定吸光度值。根據葡萄糖標準溶液回歸方程計算粗酶液中葡萄糖質量濃度[7]。

1.2 發酵培養基成分及培養條件的 Plackett-Burman試驗

在豆豉發酵的單因素預試驗中，合適的碳源，氮源和無機鹽及接種量、發酵時間、發酵溫度是果糖，糊精，蛋白胨，氯化鉀 ，接種量8%，發酵時間5 d，發酵溫度34 ℃對β-葡萄糖苷酶的酶活有明顯的正面影響。因此，它們被選為PB設計的媒介組合。對于PB設計，在兩個級別（級別+1和級別-1，如表1所示）中評估七個變量和四個虛擬變量。根據PB設計，表1中顯示了培養基的成分濃度，此階段試驗設計、數據分析及模型建立由Design-Expert軟件8.06（Stat-Ease，Inc.，Minneapolis，USA）進行[15]。

1.3 數據分析

各項指標重復測定至少3次，取其平均值，通過Design-Expert 8.06和SPSS 21.0分析數據。

2 結果與分析

應用基于統計學的試驗設計來優化培養基是研究幾種因素的影響和提高產量的有效方法。PB統計試驗設計是兩級因子設計的一部分，允許用至少“n”個試驗[11]研究“n-1”變量，這對于發現影響因素的重要性非常有用[16]。

因此，以果糖、糊精、蛋白胨、氯化鉀、接種量、發酵時間、發酵溫度為考查對象，按照Plackett-Burman設計進行了12次試驗（表 2）。表2結果的方差分析如表3所示。

對試驗結果進行方差分析表明，蛋白胨（X2）、發酵時間（X8）對β-葡萄糖苷酶酶活有顯著影響（P<0.05），其他5個因素的影響不顯著（P>0.05）不進入模型。此模型P<0.05，說明合適。因此，在忽略了不重要的條件（P>0.05）后，用一個修正的一階方程用編碼因子描述了β-葡萄糖苷酶酶活，由試驗數據擬合得到的模型方程為 ：

Y=0.733+0.074X2+0.07X8（1）

（1）式表明蛋白胨濃度和發酵時間對β-葡萄糖苷酶酶活有影響，即高濃度的蛋白胨可以提高β-葡萄糖苷酶酶活。這可能是由于蛋白胨中含有促進產酶的營養成分;同時，較長的發酵時間也能提高β-葡萄糖苷酶酶活。同時根據（1）式可得，經優化后β-葡萄糖苷酶酶活的理論值可以達到0.87 U/g。

根據他和PB設計，優化培養基應有：X2、X8取高水平，其他因素水平取低水平，用優化的培養基在30 ℃培養，做6組平行試驗。結果如表4所示。

所得β-葡萄糖苷酶酶活為0.9914 U/g（表4），高于預測值0.87 U/g?；痉项A測的優化結果。表明PB設計的試驗結果是可信的，根據前期試驗已知基礎培養基酶活為：0.2601 U/g。因此，通過PB試驗設計，β-葡萄糖苷酶的酶活提高了3.8倍。

PB試驗結果也表明PB試驗是尋找影響微生物培養的主要影響因素的有效手段。陳志杰等[17]也利用PB 設計在靈芝生長及產胞外多糖主要影響因子為蔗糖 、磷酸二氫鉀、和硫酸鋅;李翠琴等[15]通過PB設計發現影響黑曲霉GZUF36產脂肪酶培養的主要因子為葡萄糖，豆餅粉和氯化鉀，通過PB設計其產脂肪酶活力提高了0.78倍。本試驗也取得了良好結果，為后續的進一步如何提高解淀粉芽孢桿菌GUTU06產水解銀杏黃酮苷的β-葡萄糖苷酶的酶活力試驗指明了方向和奠定基礎。

3 結論與討論

本試驗通過PB設計尋找影響產水解銀杏黃酮苷的新菌株解淀粉芽孢桿菌GUTU06的產酶培養的主要因素，以提高其β-葡萄糖苷酶的活力。評價指標是β-葡萄糖苷酶水解銀杏黃酮苷的能力。研究了4種培養基成分和3種培養條件的作用，發現蛋白胨和發酵時間是影響解淀粉芽孢桿菌GUTU06β-葡萄糖苷酶的活力的重要因素。在此基礎上獲得了初步優化的培養條件，其中提高后β-葡萄糖苷酶的活力為0.9914 U/g。與使用初始培養基相比，β-葡萄糖苷酶的活力增加了3.8倍。該研究為使用響應面優化技術進一步優化β-葡萄糖苷酶和產業化應用此酶水解銀杏黃酮苷制備銀杏黃酮苷元奠定了基礎。

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