異源雙根對連作障礙下咖啡幼苗氧化損傷的緩解效應

孫燕 董云萍 龍宇宙 林興軍 趙青云 譚軍

摘 ?要：以中粒種咖啡‘熱研1號（Caffea canephora ‘Reyan No. 1）和大粒種咖啡1號（Caffea liberica No. 1）形成中粒種-大粒種異源雙根咖啡和中粒種-中粒種同源雙根咖啡，利用連作障礙咖啡園土壤開展幼苗培養試驗，包括根際土培養異源雙根咖啡（T1）和同源雙根咖啡（T2），非根際土培養異源雙根咖啡（T3）和同源雙根咖啡（T4）。通過比較各處理植株過氧化氫（H2O2）及丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性及非酶抗氧化物含量，探討異源雙根對連作障礙下咖啡幼苗氧化損傷的緩解效應。結果表明：根際土培養后，T1較T2處理植株超氧化物歧化酶（SOD）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）等抗氧化酶活性顯著提高，脫氫抗壞血酸（DHA）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）等非酶抗氧化物含量顯著下降，H2O2及MDA含量顯著下降，連作障礙下異源雙根咖啡較同源雙根咖啡受氧化損傷影響小。T1、T3處理間或T2、T4處理間，植株葉片H2O2及MDA含量差異均不顯著;且葉片氧化損傷評價指標與植株抗氧化系統指標的相關性較差，葉片對連作逆境較不敏感。根系H2O2含量在T1、T3處理間或T2、T4處理間差異顯著，而MDA含量在T1、T3處理間差異不顯著，在T2、T4處理間差異顯著，連作逆境使植株根系產生較多活性氧;根系氧化損傷評價指標與根系DHA、還原型谷胱甘肽（GSH）、GSSG含量極顯著正相關，與SOD、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性極顯著負相關，并且，與葉片DHA、GSH、GSSG含量及POD活性顯著或極顯著正相關，與SOD、GR、MDHAR、抗壞血酸氧化酶（AAO）、DHAR活性顯著或極顯著負相關，根系氧化損傷受根系及葉片抗氧化系統的共同影響。綜上，連作障礙下，同源雙根咖啡根系受氧化損傷大，異源雙根咖啡通過根系及葉片抗氧化系統緩解根系氧化損傷。

關鍵詞：咖啡;連作障礙;異源雙根;抗氧化酶;非酶抗氧化物

Abstract： The soil of the continuous cropping obstacle garden of coffee was used to cultivate Caffea canephora ‘Reyan No. 1 / C. liberica No. 1 heterologous double-root grafting coffee seedlings and C. canephora ‘Reyan No. 1 homologous double-root grafting coffee seedlings. In order to study the mitigative effect of heterologous double-root on the oxidative damage of coffee seedlings under continuous cropping obstacle， the contents of H2O2， MDA and non-enzyme antioxidant and antioxidant enzyme activity among heterologous double-root coffee in rhizosphere soil （T1）， homologous double-root coffee in rhizosphere soil （T2）， heterologous double-root coffee in non-rhizosphere soil （T3） and homologous double-root coffee in non-rhizosphere soil （T4） were observed. The results indicated that compared with T2， the activity of SOD and MDHAR was significantly increased， and the content of DHA， GSSG， H2O2 and MDA was significantly decreased in T1. The oxidative damage of the heterologous double-root coffee was less than that of the homologous double-root coffee under the continuous cropping obstacle. There were no significant differences in H2O2 and MDA content in the leaves between T1 and T3 or T2 and T4， and the correlation between the evaluation indexes of the leaf oxidative damage and the indexes of plant antioxidant system was poor. The leaves were less sensitive to continuous cropping stress. There was significant difference in H2O2 content in roots between T1 and T3 or T2 and T4. There was no significant difference in MDA content between T1 and T3， but significant difference between T2 and T4. More root active oxygen species were produced under continuous cropping obstacle. The evaluation indexes of the root oxidative damage were very significant positively correlated with the content of DHA， GSH， GSSG， and very significant negatively correlated with the activity of SOD， POD， APX， GR， DHAR and MDHAR in roots. Also， the evaluation indexes of the root oxidative damage were significantly or very significantly positively correlated with the content of DHA， GSH， GSSG and the activity of POD， and significantly or very significantly negatively correlated with the activity of SOD， GR， MDHAR， AAO and DHAR in leaves. The root oxidative damage was affected by both the root and leaf antioxidant system. In summary， the roots of the homologous double-root coffee were more damaged by oxidation than those of the heterologous double-root coffee under the continuous cropping obstacle， and the root oxidative damage of the heterologous double-root coffee was alleviated by the root and leaf antioxidant system.

Keywords： coffee; continuous cropping obstacle; heterologous double-root; antioxidant enzyme; non-enzyme antioxidant

咖啡是我國熱區重要的多年生優勢特色作物[1-2]，然而，由于主栽品種中粒種咖啡連作栽培后根系細胞膜脂過氧化損傷嚴重，根系活力顯著下降，極大地影響了咖啡產量，嚴重時甚至出現絕產、死株，連作障礙已成為咖啡種植業發展的最大限制因素[3-4]。針對連作障礙問題，茄子[5-6]、西瓜[7-9]等作物采用抗逆砧木嫁接主栽品種的方式改善根系生長狀況，恢復植株長勢。大粒種咖啡根系發達[10-11]，課題組前期研究也發現，以大粒種為砧木，中粒種為接穗的單砧嫁接苗，通過提高根系超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性，能有效清除連作障礙下誘導的過氧化氫（H2O2）等活性氧，減輕植株根系細胞膜氧化損傷，較中粒種自根嫁接苗，單砧嫁接苗根系丙二醛（MDA）含量顯著下降，大粒種砧木表現出抗連作障礙優勢[12]。

鑒于連作障礙咖啡園重新定植咖啡后，植株需要2～3年才能掛果，非生產期較長[1-2]，為此，嘗試直接在園內中粒種上靠接大粒種砧木，形成的異源雙根對恢復植株長勢作用明顯，這為減少多年生作物更新換代損失、快速恢復生產提供了新的思路。然而，異源雙根靠接是否可以穩定地改善植株長勢，及其緩解咖啡連作障礙的機制目前尚不清楚。因此，本研究以中粒種咖啡‘熱研1號和大粒種咖啡1號靠接形成異源雙根咖啡，利用連作障礙咖啡園土壤開展幼苗培養試驗，通過測定植株葉片和根系的H2O2及MDA含量、抗氧化酶活性及非酶抗氧化物含量，探討異源雙根緩解咖啡連作障礙的機制，以期為優化異源雙根靠接技術并推廣應用提供理論支持。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

主栽品種中粒種咖啡‘熱研1號和大粒種咖啡1號的種子經沙床催芽，待子葉平展時選取長勢一致的幼苗，進行中粒種與大粒種、中粒種與中粒種靠接，保證靠接口離地位置相同。成活后均保留雙根系，以保證2個供試材料根系量大體一致。地上部選留一條中粒種接穗，并在靠接口以上相同位置芽接‘熱研1號高產無性系，解綁后選取長勢一致，健壯的10月齡中粒種-大粒種異源雙根咖啡和中粒種-中粒種同源雙根咖啡作為試驗材料。

1.2 ?方法

1.2.1 ?試驗設計 ?試驗于中國熱帶農業科學院香料飲料研究所人工氣候室進行，以連作障礙咖啡園植株根際土、非根際土開展幼苗培養試驗。試驗包括4個處理：T1為異源雙根咖啡在根際土中培養;T2為同源雙根咖啡在根際土中培養;T3為異源雙根咖啡在非根際土中培養;T4為同源雙根咖啡在非根際土中培養。將幼苗移至裝有5?kg土壤的營養缽中，淋足定根水，每個處理10盆，3次重復。土壤肥力特征見表1。培養過程中每隔2?d淋水1次，保持土壤濕潤，控制蔭蔽度50%、溫度27?℃左右，每隔90 d淋0.1%水溶肥（N-P-K：15-15-15）1次，澆灌量0.5?L/盆，其他管理按常規。培養前測定土壤肥力指標，培養1?a后分別取葉片和根系樣，液氮速凍，?80?℃保存，用于測定H2O2及MDA含量、抗氧化酶活性和非酶抗氧化物含量。

1.2.2 ?測定指標 ?（1）土壤肥力指標。參照鮑士旦[13]的方法分別測定根際土和非根際土pH、EC、有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀、鈣、鎂含量。

（2）H2O2及MDA含量。分別測定葉片和根系過氧化氫（H2O2）及丙二醛（MDA）含量，測定方法參照試劑盒說明書。

（3）抗氧化酶活性。分別測定葉片和根系超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸氧化酶（AAO）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性，測定方法參照試劑盒說明書。

（4）非酶抗氧化物含量。分別測定葉片和根系還原型抗壞血酸（AsA）、脫氫抗壞血酸（DHA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量，測定方法參照試劑盒說明書。

1.3 ?數據處理

采用Excel 2010軟件進行試驗數據的整理與分析，采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，采用Duncans法進行多重比較。

2 ?結果與分析

2.1 ?異源雙根對連作障礙下咖啡幼苗H2O2及MDA含量的影響

連作障礙咖啡園根際土培養后，異源雙根咖啡較同源雙根咖啡受氧化損傷影響小。較T2處理，T1處理植株H2O2及MDA含量在葉片中分別下降16.42%和46.84%，在根系中分別下降29.54%和47.67%，各指標處理間差異均達顯著水平;連作障礙咖啡園非根際土培養后，較T4處理，T3處理植株H2O2及MDA含量在葉片中分別下降15.32%和26.31%，在根系中分別下降32.68%和20.64%，各指標處理間差異均達顯著水平，與異源、同源雙根咖啡在根際土中表現出的差異相似。在根際土和非根際土中，異源雙根咖啡或同源雙根咖啡的葉片H2O2及MDA含量差異均不顯著;根系H2O2含量差異顯著，MDA含量在異源雙根咖啡的2個處理間差異不顯著，在同源雙根咖啡的2個處理間差異顯著。T1、T3處理間，或T2、T4處理間植株葉片各指標差異均不顯著，連作逆境未加重植株葉片氧化損傷;T3較T1處理，或T4較T2處理植株根系H2O2含量均差異顯著，降幅分別為41.68%和38.96%，根系MDA含量在T1、T3處理間差異不顯著，而T4較T2處理顯著下降，降幅為23.36%，連作逆境使植株根系產生較多的活性氧，并且對同源雙根咖啡的氧化損傷較大（表2）。

2.2 ?異源雙根對連作障礙下咖啡幼苗抗氧化酶活性的影響

連作障礙咖啡園根際土培養后，異源雙根咖啡較同源雙根咖啡抗氧化酶活性高。較T2處理， T1處理植株葉片SOD、CAT、MDHAR活性均顯著提高，增幅分別為719.47%、52.05%和656.21%，其余葉片指標處理間差異均不顯著，根系SOD、CAT、MDHAR、APX活性均顯著提高，增幅分別為216.37%、59.84%、1560.00%和74.70%，其余根系指標除AAO外，處理間差異均不顯著;連作障礙咖啡園非根際土培養后，較T4處理，T3處理植株葉片SOD、POD、CAT、APX活性均顯著提高，增幅分別為64.18%、60.07%、45.38%和37.78%，其余葉片指標除AAO、GR外，處理間差異均不顯著，根系中除GR外，其余指標T3較T4處理均顯著提高，與根際土培養結果相似，異源雙根咖啡較同源雙根咖啡表現出更高的抗氧化酶活性。較根際土，經非根際土培養后，同源雙根咖啡葉片、根系，及異源雙根咖啡根系的抗氧化酶活性均較高，而異源雙根咖啡葉片抗氧化酶活性趨勢不明顯。較T2處理，T4處理植株葉片SOD、AAO、MDHAR、GR、DHAR活性，及根系SOD、POD、MDHAR、APX、GR、DHAR活性均顯著提高，與2個處理植株氧化損傷程度的趨勢相反。較T1處理，T3處理植株根系SOD、POD、AAO、APX、GR、DHAR活性，及葉片AAO、APX、GR、DHAR活性均顯著提高，而葉片SOD、POD、CAT、MDHAR活性顯著下降，總體來說，與2個處理植株根系氧化損傷程度的趨勢相反（表3）。

2.3 ?異源雙根對連作障礙下咖啡幼苗非酶抗氧化物含量的影響

較T2處理，T1處理植株葉片、根系的DHA、GSH、GSSG含量均顯著下降，AsA含量在葉片顯著下降，在根系顯著提高，較T4處理，T3處理植株葉片、根系的AsA含量顯著提高，其余指標在處理間差異均不顯著，異源雙根咖啡和同源雙根咖啡的非酶抗氧化物經根際土或非根際土培養后變化趨勢較一致，而作用趨勢不同。較T3處理，T1處理植株葉片AsA含量顯著下降，GSSG含量顯著提高，DHA、GSH含量處理間差異不顯著，較T4處理，T2處理植株葉片GSH、GSSG含量顯著提高，AsA、DHA含量處理間差異不顯著。T1較T3處理，或T2較T4處理植株根系非酶抗氧化物各指標含量均顯著提高，異源雙根咖啡或同源雙根咖啡的非酶抗氧化物經根際土和非根際土培養后變化趨勢較一致，而作用趨勢不同（表4）。

2.4 ?氧化損傷評價指標和抗氧化系統各指標的相關性分析

葉片的H2O2含量與DHA含量顯著正相關，與SOD活性極顯著負相關，與POD、CAT、AAO、MDHAR、APX、GR、DHAR活性及MDA、AsA、GSH、GSSG含量相關性均不顯著;葉片的MDA含量與SOD、CAT、MDHAR活性極顯著負相關，與POD、AAO、APX、GR、DHAR活性及AsA、DHA、GSH、GSSG含量相關性均不顯著。根系的H2O2含量與MDA含量顯著正相關，與DHA、GSH、GSSG含量極顯著正相關，與SOD、POD、APX、GR、DHAR活性極顯著負相關，與CAT、AAO、MDHAR活性及AsA含量相關性不顯著;根系的MDA含量與GSH含量顯著正相關，與MDHAR、APX活性極顯著負相關，與SOD、POD、CAT、AAO、GR、DHAR活性及AsA、DHA、GSSG含量相關性不顯著（表5）。

葉片H2O2含量與根系的H2O2含量顯著正相關，與DHA含量極顯著正相關，與SOD活性顯著負相關，與MDHAR、APX活性極顯著負相關;葉片MDA含量與根系的MDA含量極顯著正相關，與MDHAR活性極顯著負相關。根系H2O2含量與葉片的POD 活性及H2O2、DHA含量顯著正相關，與GSH、GSSG含量極顯著正相關，與SOD、GR活性顯著負相關，與AAO、DHAR活性極顯著負相關;根系MDA含量與葉片的DHA、GSH含量顯著正相關，與H2O2、MDA含量極顯著正相關，與SOD、MDHAR活性極顯著負相關。連作障礙下植株根系較葉片更為敏感，根系氧化損傷不僅與根系抗氧化系統密切相關，還受到葉片抗氧化系統的影響（表5）。

3 ?討論

膜脂過氧化損傷是植物在逆境下較為普遍的生理效應[14-19]。Melchiorre等[15]認為在正常情況下，細胞內H2O2等活性氧的產生和清除處于動態平衡，H2O2等含量較低，從而免遭氧化損傷。而在逆境脅迫下，H2O2大量積累，致使細胞膜脂過氧化水平加劇，MDA含量升高，同時，植株抗氧化系統參與清除活性氧，抗性品種表現為使植株免受氧化損傷或受損傷影響小，類似結論在辣椒低溫脅迫[17]、龍葵鎳脅迫[18]等研究中均有報道。本研究發現，相比中粒種-中粒種同源雙根咖啡，中粒種-大粒種異源雙根咖啡在連作障礙咖啡園根際土和非根際土中受氧化損傷的影響均較小。根際土培養后，異源雙根咖啡T1處理較同源雙根咖啡T2處理植株SOD、MDHAR等抗氧化酶活性顯著提高，DHA、GSSG等非酶抗氧化物含量顯著下降;非根際土培養后，異源雙根咖啡T3處理較同源雙根咖啡T4處理植株SOD、POD等抗氧化酶活性顯著提高，在2種土培條件下，異源雙根咖啡H2O2及MDA含量均顯著下降，植株抗氧化能力強。干旱脅迫下，構樹通過增加葉片SOD、POD等酶活性減輕氧化損傷，SOD、POD在脅迫后第14天活性最高，酶活性在整個脅迫過程中呈先升高后下降的變化趨勢[20]。異源雙根咖啡在連作逆境中表現出的生長優勢，是因為植株本身抗氧化能力強，還是在連作逆境中抗氧化系統進一步發生變化所致，還需分期取樣確定。

抗氧化系統有清除活性氧的生理功能，然而，關于逆境脅迫對植物抗氧化系統影響的結論卻不盡相同，這可能與植物種類、逆境類型、脅迫程度等有關[21-25]。鉛鉻復合脅迫后小麥CAT活性升高，鉛鉻單一脅迫后POD和SOD活性升高[21];輕度干旱脅迫后，中粒種咖啡幼苗葉片SOD、POD、CAT活性極顯著升高，MDA含量無顯著變化，但中度或重度干旱脅迫后，酶活性極顯著下降，MDA含量顯著升高[22]。在根際土和非根際土中，異源雙根咖啡T1、T3處理間，或同源雙根咖啡T2、T4處理間，植株葉片H2O2及MDA含量差異均不顯著，連作逆境未加重植株葉片氧化損傷。相關性分析也發現，葉片氧化損傷評價指標除了與DHA含量顯著正相關，與SOD、CAT、MDHAR活性極顯著負相關，與其他指標相關性均不顯著，因此判斷咖啡葉片對連作逆境較不敏感。根系H2O2含量在T1、T3處理間，或T2、T4處理間差異顯著，而MDA含量在T1、T3處理間差異不顯著，在T2、T4處理間差異顯著，連作逆境使植株根系產生較多的活性氧，并且對同源雙根咖啡根系的氧化損傷較大。通過相關性分析發現，咖啡根系氧化損傷評價指標與根系DHA、GSH、GSSG含量極顯著正相關，與SOD、POD、APX、GR、DHAR、MDHAR活性極顯著負相關，并且，與葉片DHA、GSH、GSSG含量及POD活性顯著或極顯著正相關，與SOD、GR、MDHAR、AAO、DHAR活性顯著或極顯著負相關，咖啡根系氧化損傷不僅與根系抗氧化系統密切相關，還受到葉片抗氧化系統的影響。綜上所述，在連作障礙條件下，同源雙根咖啡根系受氧化損傷大，異源雙根咖啡通過根系及葉片抗氧化系統共同緩解根系氧化損傷，具體是因為異源的大粒種根系在起作用，還是雙根間的相互作用，有待進一步分根取樣明確。

參考文獻

中國熱帶農業科學院， 華南熱帶農業大學. 中國熱帶作物栽培學[M]. 北京： 中國農業出版社， 1998： 438-439.

孫 ?燕， 龍宇宙. 咖啡栽培技術[M]. 北京： 中國農業出版社， 2016： 1-3.

Zhao Q Y， Xiong W， Xing Y Z， et al. Long-term coffee monoculture alters soil chemical properties and microbial communities[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 6116-6126.

孫 ?燕， 董云萍， 龍宇宙， 等. 種間嫁接對連作障礙土壤上咖啡生長及養分吸收特性的影響[J]. 熱帶農業科學， 2019， 39（8）： 5-10.

陳紹莉， 周寶利， 尹玉玲， 等. 茄子自毒物質脅迫下嫁接對其生長及土壤生化特性的影響[J]. 園藝學報， 2010， 37（6）： 906-914.

魏國平. 耐鹽砧木嫁接提高茄子耐硝酸鈣的生理機制[D]. 南京： 南京農業大學， 2009.

Colla G， Rouphael Y， Cardarelli M， et al. The effectiveness of grafting to improve alkalinity tolerance in watermelon[J]. Environmental and Experimental Botany， 2010， 68（3）： 283-291.

孟佳麗， 吳紹軍， 余 ?翔， 等. 不同類型砧木對西瓜連作障礙消減的影響[J]. 西北農業學報， 2019， 28（7）： 1110- 1118.

陽燕娟， 郭世榮， 于文進， 等. 嫁接對鹽脅迫下西瓜幼苗體內離子和內源激素含量與分布的影響[J]. 西北植物學報， 2015， 35（3）： 500-507.

江 ?梅. 不同土壤條件下中粒種和大粒種咖啡的根系活動類型[J]. 世界熱帶農業信息， 1994（4）： 14.

閆 ?林， 董云萍， 黃麗芳， 等. 咖啡種間嫁接與不嫁接植株主要農藝和品質性狀比較[J]. 熱帶作物學報， 2019， 40（7）： 1253-1258.

孫 ?燕， 楊建峰， 董云萍， 等. 咖啡根系分泌物對嫁接后植株生長及葉片保護酶活性的影響[J]. 生態學雜志， 2017， 36（5）： 1310-1314.

鮑士旦. 土壤農化分析[M]. 3版， 北京： 中國農業出版社， 2000.

Fridovich I. The biology of oxygen radicals[J]. Science， 1978， 201： 875-880.

Melchiorre M， Robert G A N， Trippi V， et al. Superoxide dismutase and glutathione reductase overexpression in wheat protoplast： Photooxidative stress tolerance and changes in cellular redox state[J]. Plant Growth Regulation， 2009， 57（1）： 57-68.

陳 ?月， 孫憲芝， 楊景慧， 等. 水分脅迫下嫁接對杭白菊滲透調節物質及相關代謝酶基因表達的影響[J]. 植物生理學報， 2018， 54（5）： 895-903.

Airaki M， Leterrier M， Mateos R M， et al. Metabolism of reactive oxygen species and reactive nitrogen species in pepper （Capsicum annuum L.） plants under low temperature stress[J]. Plant Cell and Environment， 2012， 35（2）： 281-295.

Soares C， Sousa A D， Pinto A， et al. Effect of 24-epibrassinolide on ROS content， antioxidant system， lipid peroxidation and Ni uptake in Solanum nigrum L. under Ni stress[J]. Environmental and Experimental Botany， 2016， 122（2）： 115-125.

Pinheiro H A， Da Matta F M， Chaves A R M， et al. Drought tolerance in relation to protection against oxidative stress in clones of Coffea canephora subjected to long-term drought[J]. Plant Science， 2004， 167（6）： 1307-1314.

吳永波， 葉 ?波. 高溫干旱復合脅迫對構樹幼苗抗氧化酶活性和活性氧代謝的影響[J]. 生態學報， 2016， 36（2）： 403-410.

楊文玲， 鞏 ?濤， 劉瑩瑩， 等. 鉛鉻脅迫對小麥幼苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響[J]. 中國農學通報， 2015， 31（6）： 45-50.

楊華庚， 顏速亮， 陳慧娟， 等. 干旱脅迫對中粒種咖啡幼苗膜脂過氧化、抗氧化酶活性和滲透調節物質含量的影響[J]. 熱帶作物學報， 2014， 35（5）： 944-949.

李 ?華. 嫁接對Cu脅迫下黃瓜幼苗生理生化指標和根系分泌物的影響[D]. 泰安： 山東農業大學， 2015.

周建朝， 林曉坤， 王孝純， 等. 低磷脅迫對不同基因型甜菜抗性生理特征的效應[J]. 植物營養與肥料學報， 2010， 16（6）： 1379-1386.

Jamil M， Rha E S. NaCl stress-induced reduction in growth， photosynthesis and protein in mustard[J]. Journal of Agricultural Science， 2013， 5（9）： 114-127.

責任編輯：謝龍蓮