扶正消積膠囊對胃癌細胞BGC-823的增殖抑制及凋亡的影響

薛剛 劉杰 許利軍 石建 凌博凡

摘要 目的：研究扶正消積膠囊在體外對人胃癌細胞BGC-823增殖抑制及凋亡的影響。方法：MTT實驗檢測扶正消積膠囊對BGC-823細胞增殖的影響;流式細胞儀檢測其對BGC-823細胞凋亡的影響;Real Time-PCR、Western blotting實驗檢測其凋亡相關基因表達。結果：與空白組比較，BGC-823細胞的增殖能被扶正消積膠囊顯著抑制（給藥24 h），此抑制率隨給藥劑量的增加而上升，在劑量為5 mg/ mL時，其抑制率達86.71%，且這種抑制呈劑量依賴關系。Annexin V/PI雙染法聯合流式細胞儀結果顯示扶正消積膠囊能誘導BGC-823細胞凋亡，BGC-823細胞早期凋亡率隨給藥劑量的增加，在給藥劑量分別為2.5 mg/mL、5 mg/mL時，BGC-823細胞早期凋亡率分別達到15.76%、38.25%;Western blotting、Real Time-PCR結果表明，Procaspase-3、9蛋白酶表達隨劑量的增加而明顯減小，Bcl-2、Bcl-xl、Survivin 3種基因表達隨給藥劑量的增加而下降，Bax基因表達則相反。結論：扶正消積膠囊能通過激活caspase級聯反應抑制胃癌細胞增殖并誘導其凋亡。

關鍵詞 扶正消積膠囊;BGC-823胃癌細胞;腫瘤;增殖;凋亡

Abstract Objective：To investigate the influence of Fuzheng Xiaoji Capsule on the proliferation inhibition of human gastric cancer cell BGC-823 and its apoptosis.Methods：Effects of Fuzheng Xiaoji Capsule on proliferation of BGC-823 cells were investigated with MTT assay.Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis while the effect of apoptosis related gene of Fuzheng Xiaoji capsule on BGC-823 cell was measured by real time-PCR and Western blotting.Results：MTT assay showed that the BGC-823 cells were inhibited by Fuzheng Xiaoji Capsule compared with control group，after treated on 24 h.The inhibition rate increases with the increase of dose，which is dose dependent.At the dose of 5 mg/mL，the inhibition rate reached 86.71%（P<0.05）.Flow cytometry demonstrated that Fuzheng Xiaoji Capsule could induce the apoptosis of BGC-823 cells.The early apoptosis rate of BGC-823 cells increased with the dose of the drug.At the dose of 2.5 mg/mL and 5 mg/mL，respectively，the early apoptosis of BGC-823 cells reached 15.76% and 38.25% respectively.By the results of Western blotting and real time-PCR，the expression of caspase-3、caspase-9 was significantly lower as the dose increased.Also，it could reduce the activity of Bcl-2，Bcl-xl，Survivin and increase the activity of Bax.Conclusion：Fuzheng Xiaoji Capsule could inhibit the proliferation of BGC-823 cells and induce their apoptosis.The possible mechanism was through activation of caspase cascade reaction.

Keywords Fuzheng Xiaoji Capsule; BGC-823 human gastric cancer cell; Cancer; Proliferation; Apoptosis

中圖分類號：R273文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.005

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，也是我國常見的惡性腫瘤之一，在我國西北以及東部沿海地區胃癌發病率高居首位[1-3]。手術仍是目前治療胃癌的主要手段，術后化療在胃癌治療中占重要地位，不良反應是大多數胃癌患者無法完成既定化療療程的主要原因。近年來，中醫藥在治療胃癌方面取得重大進展，尤其是在改善臨床癥狀、提高生命質量、延長生存時間等方面療效肯定[4-5]。臨床工作中，中藥與化療相結合既能提高化療效果，亦能減輕化療不良反應。

扶正消積膠囊為如皋市中醫院院內制劑，具有益氣健脾、解毒消積、活血通絡、抗癌止痛之功效。多年的臨床使用發現，扶正消積膠囊治療各類腫瘤具有相當好的療效，因而我們以胃癌細胞為目標進行實驗，探討扶正消積膠囊治療胃癌的相關分子機制[6-7]，進一步為扶正消積膠囊臨床治療打下堅實的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人胃癌細胞株BGC-823，購買自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，培養液用1640培養液（含10%小牛血清以及1%雙抗），孵箱環境：37 ℃以及含5%CO2。

1.1.2 藥物 扶正消積膠囊（組成：黃芪、白花蛇舌草、水紅花子、黨參、生大黃、三棱、炒薏苡仁、莪術、蜈蚣、炙鱉甲、西洋參、參三七、全蝎），如皋市中醫藥院內制劑;蘇藥制字Z04001609，生產批號：100614。

1.1.3 試劑與儀器 1640培養液（Gibco公司，美國，貨號：2058872）;胎牛血清（常州四季青公司，貨號：22011-8612）;四甲基偶氮唑藍（MTT）（Biosharp公司，貨號：BS186）;流式凋亡試劑盒（凱基公司，貨號：KGA107）;逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本，貨號：RR820A）;β-actin一抗（Sigma公司，美國，貨號：MAB1501）;Caspase-3一抗（貨號：SC-2375）、Caspase-9一抗（貨號：SC-2146）、Bax一抗（貨號：SC-2314）、Bcl-2一抗（貨號：SC-2319），以上購自美國Santa cruz公司;山羊抗鼠二抗（貨號：20180515）、山羊抗兔二抗（貨號：20180536），以上購自北京中杉生物技術公司;全自動酶標儀（BioTek公司，美國，型號：00099192）;超速離心機（型號：ZCKP20181200100019）、流式細胞儀（型號：ZCKP020200300100413）、ABI熒光定量PCR儀（型號：ZCKP0201301001001331）、伯樂凝膠成像儀（型號：ZCKP020130100100132），以上購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗 將細胞接種于96孔板，每孔8×103個細胞，培育12 h，待細胞貼壁后，觀察組給予扶正消積膠囊，根據預實驗結果，選擇劑量依次為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL，0.625 mg/mL;另設1個陰性對照組，含1‰DMSO的1640培養液，對照組不加任何藥物，培養24 h后，向96孔中每孔加入120 μL 1640培養液，其中含MTT 20 μL，培養箱中培育4 h后，棄上清液，酶標儀490 nm波長測量96孔板每孔的吸光值，計算扶正消積膠囊對BGC-823細胞增殖的抑制率，抑制率=（1-觀察組/對照組）×100%，實驗重復3次，取3次結果的平均值，繪制成柱狀圖。

1.2.2 Annexin-V/PI雙染法 消化下貼壁細胞，接種于直徑為6 cm的培養皿，每個培養皿3×105個細胞，放置培養箱，待細胞貼壁后給藥，設2個給藥組劑量分別為5 mg/ mL、2.5 mg/mL，1個5-FU陽性對照組50 μg/ mL，1個不加任何藥物的空白對照組。24 h后，離心收集消化下來的細胞，每組中加入Binding Buffer 500 μL，重懸各管，向各管中加入5 μL PI以及5 μL Annexin-V，隨后在暗室中避光振蕩約10 min，在流式細胞儀中檢測各藥物劑量的胃癌細胞凋亡情況。

1.2.3 RT-PCR實驗 消化下貼壁細胞，接種于直徑為6 cm的培養皿，給藥方法同上，24 h后，提取各劑量組細胞總RNA，紫外分光光度計計算出所提取RNA質量，經TaKaRa RT逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，逆轉錄完成后，根據Primer Premier 3.0軟件分別設計PCR引物。見表1。隨后進行聚合酶鏈式反應（PCR）。將PCR Forward Primer（10 μmol/L）、Power SYBR Green（2×）、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）、dH2O體系混合，7500Fast PCR儀行擴增反應，先是預變性：95 ℃ 30 s，循環1次;然后PCR：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環40次，最后進行融解曲線分析：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s，循環1次，實驗中設置3個復孔，提煉出不同標本Ct值。公式△Ct=目的基因Ct值-內參照基因Ct值（內參為β-actin），△△Ct=觀察組△Ct-對照組△Ct，得出各劑量組標本RQ值（RQ=2-△△Ct）。結果繪制成柱狀圖。實驗重復3次，取3次實驗平均值。

1.2.4 Western Blotting實驗 將消化下來的胃癌細胞接種于直徑為10 cm的培養皿，給藥方法同上，給藥24 h后，提取各組劑量相關蛋白，隨后用Bradford法進行蛋白劑量測量，不同劑量組各取20 μg蛋白經SDS PAGE分離后轉到PVDF膜上，轉膜結束后，有蛋白一面向上放入預先配制好的5%牛奶封閉液中封閉1 h，再向塑封膜里加入一抗，放置于4 ℃冰箱過夜，次日取出PVDF膜，濾紙貼角稍吸干，PBST溶液洗去一抗，加入二抗，室溫孵育1 h后，同上洗去二抗，向PVDF膜上滴入ECL液，予暗室中進行發光，最后得出Western Blotting條帶。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，各組兩兩比較采用q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 扶正消積膠囊對人胃癌細胞BGC-823的增殖抑制 經MTT實驗檢測，結果顯示不同劑量的扶正消積膠囊作用于BGC-823細胞24 h后，在劑量為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL時，其對BGC-823細胞抑制率分別達到（86.71±4.2）%，（68.44±5.3）%，（43.16±3.8）%，（25.63±2.9）%。見圖1。與空白對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。結果亦顯示，扶正消積膠囊對BGC-823細胞的增殖抑制率隨著給藥劑量的增加而增加，在劑量為5 mg/mL時，其對BGC-823細胞增殖抑制率達到一個峰值，呈劑量依賴關系。

2.2 扶正消積膠囊對人胃癌細胞BGC-823凋亡的影響 通過MTT試驗，我們檢測出不同劑量扶正消積膠囊作用胃癌細胞BGC-823 24 h的抑制率，據此，我們選用一個高劑量5 mg/mL、中劑量2.5 mg/mL以及用常見的化療藥物5-FU作為陽性對照組作為檢測藥物劑量，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡結果示：扶正消積膠囊在作用于人胃癌細胞BGC-823 24 h后，BGC-823細胞早期凋亡率隨著給藥劑量的增加，從6.12%增加到15.76%、38.25%（P<0.05），而5-FU陽性對照組早期凋亡為14.43%，與空白對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 扶正消積膠囊對于胃癌細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響 RT-PCR實驗結果表明，扶正消積膠囊作用于人胃癌細胞BGC-823 24 h后，Bcl-2、Bcl-xl、Survivin mRNA的表達隨劑量的上升而下降，Bax mRNA的表達則相反，表明扶正消積膠囊能下調Bcl-2、Bcl-xl、Survivin mRNA的表達，上調Bax mRNA的表達。見表2。

2.4 扶正消積膠囊對胃癌細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響 Western Blotting實驗結果表明，通過流式細胞儀檢測扶正消積膠囊對BGC-823細胞早期凋亡，結果顯示扶正消積膠囊能誘導人胃癌細胞凋亡，據此，運用Western Blotting實驗探討其誘導細胞凋亡的分子機制。在給藥24 h后，與對照組比較，5 mg/mL、2.5 mg/mL劑量組Procaspase-3、9蛋白酶表達量隨給藥劑量的增加而明顯減小，Bax蛋白條帶表達量隨著給藥劑量的上升明顯增高，Bcl-2蛋白表達則相反。根據實驗結果可以得出，扶正消積膠囊其能激活Caspase-3、9活性以及上調Bax蛋白表達下調Bcl-2蛋白表達，從而引起BGC-823細胞凋亡。見圖3、圖4。

3 討論

細胞凋亡是一種受基因調節的自主調控過程，在腫瘤的個體發育以及發病機制中有著非常重要的作用，過度增殖加上細胞凋亡程序的紊亂，是導致惡性腫瘤產生的主要原因[8]。探索腫瘤發病的機制以及尋找有效治療腫瘤的方法是現代醫學研究的熱點。根據腫瘤細胞凋亡機制，目前治療腫瘤有效的方法之一則是通過促進細胞凋亡過程的再啟動，因而目前很多學者重點研究腫瘤細胞凋亡信號通路的調控機制。根據凋亡信號的來源認為細胞凋亡是受細胞內外因子調控的[9-10]：外在的死亡受體介導通路;內在線粒體介導的內源性通路以及內質網應激（ERS）介導的凋亡通路。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（Caspase）引發的級聯反應是細胞凋亡過程的中心環節，在多種癌細胞如胃癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、宮頸癌等發現該基因的都存在異常表達[11-14]。作為最重要的細胞凋亡途徑執行因子之一，Caspase-3蛋白通過上游的啟動因子Caspase蛋白酶原（Procaspase）切割特異性底物，激活下游Caspase蛋白，從而導致細胞凋亡[15-16]。此外，目前研究亦證實了凋亡基因中存在非Caspase依賴的信號通路，Bcl-2家族蛋白就是其中一員[17-18]。根據結構以及功能不同將其家族成員分為促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad、Bim等）凋亡誘導因子和抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bel-xL、Bcl-W等）凋亡誘導因子2種類型[19-20]。有學者研究二者之間關系發現，Bcl-2家族蛋白成員間的相互作用對Caspase-3、Caspase-9凋亡通路起調控作用[21]。據此，為研究扶正消積膠囊誘導人胃癌細胞凋亡的分子機制，我們選擇探討其對線粒體介導的內源性細胞凋亡通路（Caspase-3、Caspase-9）以及Bcl-2家族蛋白（Bax、Bcl-2）的這2種蛋白表達的影響。

“扶正消積”概念取自中醫治療疾病的思想：祛邪扶正、調節機體陰陽平衡。本實驗以此為理念，探討本院院內制劑扶正消積膠囊其對胃癌細胞BGC-823凋亡表達的影響。研究發現扶正消積膠囊能抑制BGC-823細胞增殖，通過流式細胞儀聯合Annexin-V/PI雙染法實驗結果顯示，扶正消積膠囊對胃癌細胞BGC-823細胞早期凋亡率從6.12%增加到15.76%、38.25%，差異有統計學意義，呈劑量依賴關系;在基因蛋白檢測方面，結果表明：Bcl-2、Bcl-xl、Survivin基因表達則下降，Bax基因蛋白的表達隨著給藥劑量的上升而上調;Caspase上游基因Procaspase-3、9蛋白酶表達隨著劑量的增加而明顯減小，這個結果表明Caspase-3、9活性成分被剪切下來，從而激活Caspase-3、9表達，導致細胞凋亡，并且呈現劑量依賴關系。

通過本次扶正消積膠囊作用于BGC-823胃癌細胞體外實驗，發現扶正消積膠囊能顯著抑制BGC-823胃癌細胞的增殖，誘導其凋亡;其可能機制為激活Caspase通路以及下調Bcl-2、Bcl-xl、Survivin蛋白表達，上調Bax的表達。

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（2020-03-15收稿 責任編輯：芮莉莉）