近紅外光譜技術在獸藥及獸藥殘留檢測方面的應用進展

劉 佳，李 月，高 婷，王佳雅，胡曉雨，孫志文，葉能勝*，李 建*

(1. 北京市獸藥監察所，北京102629；2. 國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037；3. 首都師范大學化學系，北京 100048)

獸藥及獸藥殘留不僅涉及畜禽行業的整體穩定健康發展，更關系到公共衛生安全和人民的身體健康，加強對于獸藥及獸藥殘留的檢測對于畜禽生產安全以及食品質量安全具有重要的意義[1]。目前對于獸藥及獸藥殘留檢測的方法逐漸從稱量、滴定等理化分析法向色譜、光譜、質譜等儀器檢測方法發展，滴定等常規的分析檢測方法存在檢測耗時長、效率低、人為主觀因素影響較大等問題，而儀器檢測方法雖然準確性、靈敏度、特異性越來越高，但是樣品前處理復雜，檢測過程受儀器、實驗室和實驗人員專業性等條件的限制，如何實現獸藥及獸藥殘留的快速檢測對于畜禽行業的安全與發展具有實際性的意義。近年來，近紅外光譜技術(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)由于具有快速、高效、便攜、無損等優點，目前已逐漸在農牧、食品、化工、制藥、煙草等領域里得到了應用[2]，從而為獸藥及獸藥殘留的快速分析檢測提供了方向。本文結合國內外文獻及行業特點，對NIRS在獸藥及獸藥殘留檢測方面的應用進展進行了綜述，并對其應用前景進行展望。

1 NIRS的原理及方法特點

1.1 NIRS的分析原理 近紅外光譜區由Herschel在1800年首次發現，是介于可見光和中紅外之間的電磁輻射波，美國材料檢測協會(American Society for Testing and Materials，ASTM)將近紅外光譜區的波長范圍定義在780～2526 nm范圍內[3]。近紅外光譜區與有機分子中含氫基團(O-H、N-H、C-H)振動的合頻和各級倍頻的吸收區一致[4]，當有機物受到近紅外光源照射時，有機分子振動的非諧振性能夠使分子振動從基態向高能級躍遷，從而產生近紅外光譜吸收。不同基團或同一基團在不同的化學環境中對近紅外光譜的吸收波長及吸收強度均有明顯的差異，因此，透射過有機物的近紅外光線就會攜帶關于有機物含氫基團的特征信息以及樣品組分和結構的豐富信息。通過對有機化合物進行近紅外光譜樣品掃描，可以實現對碳氫有機物質的組成與性質的測量。

1.2 NIRS的方法特點 NIRS是一種間接分析技術，主要通過近紅外光譜儀對已知樣品進行光譜掃描，結合化學計量學與樣品的成分濃度或性質進行數據關聯建模，從而實現對未知樣品的定性、定量分析，所以NIRS的關鍵就在于已知樣品中成分濃度或性質與掃描光譜之間函數關系的建立[5]。因此，NIRS的方法建立的流程圖見圖1，具體步驟如下：①選取具有代表性的樣品進行近紅外光譜掃描；②采用標準或認可的技術方法對代表性樣品的性質或成分含量進行準確測定；③采用化學計量學的方法將代表性樣品的近紅外掃描光譜與其性質或成分含量進行有效關聯并建立模型；④對建立的數據模型進行校正優化，考察模型的適用性和準確性；⑤對未知樣品進行近紅外光譜掃描測定，實現樣品的定性、定量分析。

圖1 NIRS方法建立流程圖Fig 1 The diagram of establishment for NIRS method

目前，NIRS逐漸在不同的分析領域里得到了一定的應用及推廣，主要是由于其具有分析速度快、檢測效率高、測試重現性好、樣品無損等技術優點，不僅能夠避免常規檢測樣品前處理過程中操作復雜、環境污染等問題，而且能夠滿足現場檢測、多參數同時檢測等不同檢測需求。

2 NIRS在獸藥檢測方面的應用

獸藥質量的好壞不但直接影響到動物用藥的治療和預防效果，而且關系到獸藥及畜禽行業的健康發展。對于獸藥質量的監督和控制主要依據《中華人民共和國獸藥典》以及《獸藥質量標準》等法定技術標準對獸藥的外在及內在質量進行檢測，包括性狀、鑒別、檢查以及含量測定等項目。目前，在畜禽生產過程中常用到的獸藥包括磺胺類、氟喹諾酮類、四環素類以及中獸藥等，其質量檢測主要以感官檢測、理化分析檢測以及儀器分析檢測等方法為主，而基于NIRS對獸藥質量的檢測方法應用報道很少。本文基于NIRS在相關藥物檢測方面的應用進展進行分類介紹。

2.1 NIRS在磺胺類藥物檢測方面的應用 關于NIRS在檢測磺胺類藥物方面的應用研究有一些相關報道：吳阮琦等[6]基于近紅外漫反射光譜，結合化學計量學分析技術建立了復方磺胺甲噁唑無損檢測快速分析方法，對4個廠家13批樣品258片的均勻性進行了廠間、批間、批內檢測，結果顯示該方法能夠準確、無損、快速對復方磺胺甲噁唑的均勻性進行檢測；Lee等[7]采用近紅外光譜在線監測模式對磺胺噻唑在溶劑介導下的多態轉化機理進行了系統的研究，能夠實現對磺胺噻唑含量的準確測定；張經碩等[8]結合近紅外光譜漫反射技術與偏最小二乘多元校正法實現了復方磺胺甲噁唑片中磺胺甲噁唑和甲氧芐啶兩種有效成分含量的快速測定，定量分析模型的相關系數分別為99.969%和99.938%；余道宏等[9]利用近紅外漫反射光譜分析技術和化學計量學方法對小兒復方磺胺甲噁唑顆粒中的水分進行了快速定量分析，方法簡單、準確，可用于藥品的現場快速分析。

2.2 NIRS在喹諾酮類藥物檢測方面的應用 劉蟬[10]、張琳[11]和楊開金[12]等先后基于NIRS和化學計量學方法，采用內部交叉驗證建立預測模型和外部驗證的形式，實現了環丙沙星的無損、快速定量分析；李盈[13]和張雪峰[14]等先后應用近紅外漫反射光譜技術建立了諾氟沙星膠囊一致性檢驗的模型，不僅能夠很好的區分不同廠家生產的諾氟沙星膠囊，而且還可以用于假劣藥品的快速篩查。此外，劉楊等[15]建立了近紅外光譜法定量分析注射用甲磺酸培氟沙星的含量，在7.55%～77.69%濃度范圍內交叉驗證均方根為1.61%，相關系數能夠達到0.9924；孫逸威等[16]運用偏最小二乘法建立近紅外光譜法的校正模型，同時采用一階導數+矢量歸一化法進行方法預處理，實現了鹽酸左氧氟沙星片含量的測定，校正集合驗證集的R2分別為0.9994和0.9982；Sakamoto T等[17]利用近紅外漫反射光譜技術建立了氧氟沙星和左氧氟沙星的快速無損鑒別方法，適用于市場上藥品真假的現場鑒別；王聰穎等[18]基于NIRS和化學計量學方法分別建立了吡哌酸片一致性快速檢測模型和快速定量模型，驗證結果表明：所建方法準確、可靠，適用于廠家在線監控及監管部門篩查、假劣藥品打擊等。

2.3 NIRS在四環素類藥物及中獸藥檢測方面的應用 雖然上述研究報道了基于NIRS檢測磺胺類藥物和氟喹諾酮類藥物，但具體應用仍集中在制藥行業里藥品檢測方面，關于獸藥質量相關的檢測應用并未涉及。劉波靜等[19]采用國家標準測定了192份飼料中金霉素的含量，利用TQ Analyst分析軟件依據偏最小二乘回歸法，創建了飼料中金霉素含量測定的近紅外模型，其化學值與近紅外預測值之間具有良好的線性相關性，并對40份獨立樣品進行了驗證，預測結果良好；劉星等[20]則結合競爭性自適應重加權采樣法和偏最小二乘-線性判別分析法對100個土霉素制備飼料建立近紅外判別模型，對NIRS檢測飼料中土霉素摻雜樣品的可行性進行了研究。此外，樊克鋒等[21]采用NIRS結合化學計量學，對中獸藥蚌毒靈散中的黃芩成分進行“整體定量”，為中獸藥中有效成分的無損快速測定提供了新的技術支撐。

2.4 NIRS在其他抗生素類藥物檢測方面的應用 目前，基于NIRS對藥物的快速檢測研究除了磺胺類、喹諾酮類、四環素類以及中獸藥等常規藥物外，還有β-內酰胺類、氨基糖苷類等其他抗生素藥物，其檢測原理和檢測方法基本相同，主要采用NIRS和化學計量學方法建立不同的數據模型，實現對藥物含量、質量、水分、一致性以及藥品鑒別等指標的準確、快速分析檢測，具體內容見表1。

表1 基于NIRS在其他類抗生素類藥物檢測方面的應用Tab 1 The application of NIRS in the detection of other antibiotic drugs

藥物分類檢測藥物建模方法研究內容檢測應用參考文獻β-內酰胺類鹽酸頭孢他美酯選擇一階導數+直線差減法作為含量模型的處理方法,矢量歸一法作為水分模型的處理方法。通過對 HPLC法和NIR法測定的數據的相關性分析和回歸分析,說明這兩種方法的相關性較好,可適用于企業開展快速定量分析,實現產品在線分析。定量分析黃麗麗等[31]頭孢氨芐一階導數加矢量歸一化法處理頭孢氨芐糖衣片的內部交叉驗證決定系數和診治相關的系數分別為0.9799和0.9894,內部交叉驗證均方差為1.98和1.55,外部的驗證預測均方差為1.58和1.22,該方法適合使用在頭孢氨芐片的檢驗當中定量分析閆紅賀等[32]阿莫仙(阿莫西林)光譜預處理方法為二階導數(17點平滑)和矢量歸一化預測8批阿莫仙膠囊分別在3臺儀器上所測量光譜的平均光譜、75批內地廠家生產的阿莫西林膠囊的平均光譜,以及經過法定方法確認的6批阿莫西林膠囊假藥,正確率均為100%,實現了不同儀器用于產品在流通環節的質量追溯及監測。定性分析馮艷春等[33]美洛西林鈉舒巴坦鈉積分球漫反射采樣偏最小二乘法建立定量模型,移動塊標準偏差法的定性分析模型;一階導數+標準正態變量變換法為最佳光譜預處理方法研究中聯合應用舒巴坦鈉的定量分析模型和基于移動塊標準偏差(moving block standard deviation,MBSD)法的定性分析模型,對美洛西林鈉舒巴坦鈉混合過程進行在線監測,以實現對混合終點簡單準確的判斷。定性定量王斐等[34]頭孢氨芐/213批頭孢氨芐膠囊的質量分數濃度范圍0.4147～0.9365 mg·mg-1,內部交叉驗證決定系數(r)為97.78,內部交叉驗證均方差為2.22,外部驗證預測均方差為 2.39,預測值與真值的相關系數為 0.9879。實現了對頭孢氨芐系列制劑質量及其質量標準進行評價和分析,為頭孢氨芐系列制劑安全監管和質量標準提高提供參考定量分析鞏麗萍等[35]抗病素養類單磷酸阿糖腺苷偏最小二乘法建立定量模,一階導數及多元散射校正預處理以17個廠家生產的133批注射用單磷酸阿糖腺苷為分析對象,68批作為校正集,65批作為驗證集:內部交叉驗證決定系數為96.82%,均方根誤差為2.64%,外部驗證決定系數為97.54%,均方根誤差為2.29%?？捎糜谒幤返目焖俜治龊蜋z驗。定量分析王小亮等[36]大環內酯類抗生素羅紅霉素先使用最小二乘法建模選擇波長區間,再帶入運用BP人工神經網絡構建的預測模型該模型的建立能夠對噪聲等偶發因素造成的瞬時擾動進行有效抵御,同時還可減少建模使用的波長數、運算時間,提高預測精度?？焖僭诰€成分的測定與分析肖玥等[37]阿奇霉素用偏最小二乘法建模測定阿奇霉素分散片精密度達到了89%,方法穩定性達到了 90%;檢測速度:3 min/樣品。近紅外漫反射光譜法測定阿奇霉素分散片的含量不僅簡單方便,時間短,而且結果非常準確,可以在利用模型來進行阿奇霉素分散片含量測定的企業中含量測定曹鈺茜等[38]琥乙紅霉素基于偏最小二乘回歸算法,采用不同預處理方法對14個廠家22個批次的琥乙紅霉素片進行定量分析,包括琥乙紅霉素片含量及溶出度的測定。結果表明近紅外光譜法是一種監控琥乙紅霉素片質量的有效手段。含量及溶出度的測定肖瑩等[39]

藥物分類檢測藥物建模方法研究內容檢測應用參考文獻其他復方阿司匹林/雙嘧達 莫偏最小二乘雙嘧達莫PLS模型對8個樣品預測的回收率及相對誤差分別為97.96%-101.21%、0.046%-2.04%;阿司匹林PLS模型的回收率及相對誤差分別為94.50%-108.33%、0.781% -8.33%,可用于實際生產中的在線控制。定性分析,含量測定張衛民等[40]萘普生二階導數+矢量歸一化預處理應用近紅外光譜技術建立萘普生片一致性檢驗模型,快速鑒別假劣藥品。方法:首先采集所有批次萘普生樣品的近紅外原始光譜,然后用參考光譜建立一致性模型,最后用驗證光譜對該模型進行驗證。定性分析(用于鑒別假劣藥)徐靜等[41]吲哚美辛偏最小二乘法建立定量模選擇8個廠家生產的156批吲哚美辛腸溶片進行NIR光譜采集,樣品濃度范圍為24.61%～32.96%,用78個樣品進行外部驗證,驗證均方差(RMSEP)為0.508%,平均相對偏差為0. 45%。該方法快速、簡便,結果準確,適于藥品的現場快檢定性、定量分析吳群[42]鹽酸克林霉素光譜預處理方法為一階導數化 +矢量歸一化一致性檢驗通過比對測試圖譜與參照圖譜中的每一個波數點的CI值,可以準確快速地篩查該藥品的假劣仿品,為藥品監管人員及時發現藥品質量隱患提供技術支持。適用于假劣藥品的快速篩。定性分析周禮玲[43]琥乙紅霉素,紅霉素,克拉霉素,麥白霉素小波變換光譜預處理;稀疏降噪自編碼結合高斯過程的建模方法(wSDAGSM)對光譜數據進行墨西哥帽小波變換預處理能有效提升SDAGSM網絡的分類準確率和穩定性,無論從分類準確率還是分類結果穩定性方面,都取得了很好的效果。定性分析周潔茜等[44]豆粕和3種抗生素菌渣 (硫酸鏈霉素菌渣、土霉素菌渣、硫酸粘桿菌素菌渣)偏最小二乘判別分析 (PLS-DA)與支持向量機判別析 (SVM-DA) 結合不同的光譜預處理方法研究發現,一階導數+SNV的預處理方式優于元預處理、一階導數、二階導數;SVM-DA的模型效果優于PLS- DA,SVM-DA中特征提取方法PLS優于PCA(主成分分析)定性分析楊增玲等[45]琥乙紅霉素一階導數、矢量歸一化法預處理+數據白化處理與傳統的BP神經網絡以及 SVM算法進行比較,結果表明稀疏降噪自編碼網絡在分類準確度和分類穩定性方面均優于BP神經網絡和SVM算法。定性分析楊輝華等[46]

3 NIRS在獸藥殘留檢測方面的應用

獸藥殘留不僅影響到動物源食品的質量安全，而且也影響著畜牧業和生態環境的健康發展。目前關于畜禽產品中的獸藥殘留檢測主要依據國家標準執行，存在樣品前處理復雜、有機試劑消耗大、工作效率低等問題，雖然目前已經有酶聯免疫吸附法、膠體金試紙條檢測法等快速檢測方法，但是仍無法滿足畜禽產品獸藥殘留便捷、快速、高效檢測的要求。

近年來，先后報道了基于NIRS在獸藥殘留分析檢測方面的應用研究，主要集中在牛奶中抗生素獸藥殘留的分析檢測：SiVakesava等[47]以及Wu等[48]課題組分別采用NIRS結合偏最小二乘法實現了牛奶中四環素的殘留檢測，檢測靈敏度分別達到4 μg/L和5 μg/L，數據模型相關系數均大于0.89；Casarrubias-Torres等[49]基于中紅外光譜技術和化學計量學方法建立了牛奶中四環素類藥物殘留的快速檢測方法，10～400 μg/L線性范圍內相關系數達到0.997-0.999；Dracková等[50]基于近紅外光譜和偏最小二乘法建立了牛奶中青霉素和氯唑西林藥物殘留測定，能夠適用于牛奶中青霉素和氯唑西林最大殘留量的測定；Luiz等[51]基于NIRS對牛奶中的抗菌藥物殘留進行了檢測，采用主成分分析法實現了牛奶中恩諾沙星、土霉素以及青霉素的殘留檢測，該方法同樣適用于牛奶中抗菌藥物最大殘留限量的快速檢測。此外，Chen等[52]基于近紅外熒光技術結合免疫分析技術在20 min內實現了牛奶中內酰胺類、四環素類、喹諾酮類和磺胺類四種抗生素的快速分析檢測。

NIRS除了在牛奶中抗生素藥物殘留檢測方面取得了應用進展外，郭培源等[53]基于NIRS實現了對肉雞中四環素的定量分析，實現了雞肉中四環素殘留量的檢測并進一步進行了健康風險評估；夏慧麗等[54]通過蝦干的近紅外反射光譜與擬合的磺胺類藥物含量，建立了近紅外定量模型，實現了蝦干中磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的含量測定，模型相關系數分別達到0.98和0.94以上。

4 NIRS在獸藥及獸藥殘留檢測方面的技術瓶頸

通過文獻綜述來看，基于NIRS在獸藥質量及獸藥殘留快速檢測方面的應用研究報道確實很少，而且相關技術研究仍處于實驗室探索階段，并未形成成熟的技術路線，在獸藥及獸藥殘留檢測實際應用過程中具有一定的限制。

4.1 專業儀器的研發與改進 近紅外光譜儀的性能是NIRS在獸藥及獸藥殘留領域里應用的前提，目前在石油化工、制藥、食品、糧食等行業領域已研發出不同品牌和類型的專用近紅外光譜儀，然而在獸藥及獸藥殘留檢測方面的應用還未深入，缺乏適用于該領域里專業、便攜的近紅外光譜儀。由于近紅外的吸收范圍只適合于含氫基團組分的測定，測試靈敏度比較低，一般只適合于組分含量大于0.1%的樣品檢測，基于NIRS對于獸藥質量的分析檢測具有一定的可行性；然而由于獸藥殘留檢測主要為痕量水平，畜禽產品中獸藥殘留水平較低且基質比較復雜，需要研發獸藥殘留專業的近紅外光譜儀來完成，因此，基于NIRS除了對牛奶中獸藥殘留檢測進行了相關研究外，其他畜禽產品的研究及可行性有待進一步深入探索。

4.2 國家標準的制定與執行 獸藥監察執法機構基于NIRS能否實現對獸藥質量及畜禽產品中獸藥殘留的快速檢測與控制最重要的保障是需要具有完善的國家標準技術支持，目前不同行業基于NIRS先后頒布了相應的技術標準：歐洲、美國、我國先后將NIRS收錄在藥典中指導該技術在制藥領域中的應用[55]；石油化工行業基于NIRS也先后制定了多項行業標準以構建成品油快速檢測標準體系；我國在食品檢測、糧食品質檢測等方面均制定了多項國家標準來支持相關檢測部門采用NIRS進行質量檢測。而基于NIRS在獸藥及獸藥殘留檢測方面的標準處于空白，從而限制了NIRS在該行業的應用推廣。

4.3 數據模型的建立與維護 NIRS的應用推廣很大程度上依賴于數據模型的建立與維護，然而在實際應用過程中，數據模型的建立往往需要有經驗的專業人員依據豐富的代表樣品信息，結合化學計量學等數據處理方法來完成。獸藥數據模型的建立具有一定的可操控性，然而獸藥殘留由于代表性樣品少，檢測組分含量低等因素其數據模型的建立需要投入更多、更深入的分析研究。此外，數據模型在實際應用過程中還需要根據檢測樣品、檢測項目等條件的不斷變化而隨時對數據模型進行補充、維護來提高檢測結果的準確性。因此，如何建立和維護好獸藥及獸藥殘留基于NIRS的數據模型對于NIRS在畜禽行業中的應用具有重要意義。

5 展 望

結合NIRS的原理、方法及技術特點，通過對該技術在獸藥及獸藥殘留行業的應用分析可以看出，雖然NIRS在獸藥質量及獸藥殘留檢測方面的應用研究仍處于初級階段，但是隨著研究的不斷深入和檢測技術的不斷成熟，NIRS在獸藥及獸藥殘留檢測方面的潛在應用有望得到進一步拓展。

基于NIRS已經實現了該技術在藥品質量控制方面的相關應用，因此，對于獸藥質量的分析檢測在理論和技術上具有可行性：①有望實現對獸藥性狀、理化值、成分含量等質量指標進行快速、高效、無損、便捷的分析檢測；②有望實現獸藥生產過程中全程在線的質量控制：③有望實現中獸藥品質、產地、以及有效成分等方面鑒別；④有望實現獸藥摻偽、真偽的鑒定等。屈健[56]和張哲鋒[57]對NIRS在獸藥檢測中的應用前景進行了展望，隨著NIRS的不斷創新發展，該技術在獸藥質量檢測控制方面具有廣闊的應用空間且逐漸向便攜、專業的應用方向發展。

基于NIRS在獸藥殘留方面的檢測初步在牛奶、雞肉等組織中獸藥殘留檢測方面進行了應用探索。Min等[58]對于農藥及獸藥殘留的快速檢測方法進行了綜述，NIRS已經在農藥殘留檢測方面取得了一定的研究進展，獸藥殘留檢測也有望實現多殘留的快速檢測。雖然受基質、殘留量低等因素影響，該技術在獸藥殘留低水平級別的應用效果不好，但是隨著研究的不斷深入，通過研發專業、高靈敏的近紅外光譜儀，結合樣品前處理技術有望實現NIRS在獸藥殘留應用方面的技術突破，從而實現該技術在獸藥殘留檢測方面的應用。