基于生物阻抗譜的舌體腫瘤組織識別方法*

姚佳烽 胡松佩 楊璐 吳陽 韓偉 劉凱?

1) (南京航空航天大學機電學院, 南京 210016)

2) (南京大學醫學院, 南京大學醫學院附屬口腔醫院, 南京 210008)

基于生物阻抗譜技術, 提出一種非侵入式、快速、便捷的舌體腫瘤組織識別方法.根據舌體組織不同病理及生理狀態下電學特性的差異性來判斷其是否病變, 以幫助主刀醫師在臨床舌體腫瘤手術切除中既能完整的切除腫瘤又能盡可能多的保留患者舌功能.本文在小鼠上建立了人舌鱗癌細胞(HSC3)原位舌癌移植瘤模型, 用生物阻抗譜的方法對其正常組織區域、混有腫瘤組織區域及腫瘤組織區域進行了電學特性研究.幅值頻譜顯示在8.09 × 105 —5 × 106 Hz的高頻段可以根據其電學特性區分3種組織.在實驗過程中, 從高頻段的幅值頻譜中提取出弛豫頻率frelax、電阻抗實部 和電阻抗虛部 3個電學參數, 并根據這3個電學參數定義癌變組織系數α與β (待測組織阻抗值相對于正常組織阻抗值的實部變化百分比記為α, 虛部相對變化百分比記為β)進行腫瘤組織識別.結果表明, 當α ≤ 36.5%, β ≤ 31.2%時, 組織是正常組織; 當α ≥36.5%, β ≥ 31.2%時, 組織可能混有腫瘤組織; 當α ≥ 82.7%, β ≥ 73.6%時, 組織是腫瘤組織.

1 引 言

生物阻抗譜(bioelectrical impedance spectroscopy, BIS)是一種根據生物組織不同病理及生理狀態下電學特性的差異性提取有效電信息來分辨生物體是否病變的技術.舌癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一, 也是發病率最高的一種, 在口腔癌中牙齦及口底癌占31.0%—49.5%, 而舌癌占比高達60.8%—67.5%[1].目前, 舌癌臨床的治療方法主要有: 外科手術[2]、放射治療[3]、化療[4]等.在這些方法中手術切除可以根除舌體腫瘤, 但是必須完全切除腫瘤才能達到控制的目的, 如手術切除的范圍不夠會導致疾病復發[2,5].如何能完整的切除舌體腫瘤又能保留健康的舌組織是提高患者術后存活率及術后生存質量的關鍵.目前臨床上舌體腫瘤檢測技術包括核磁共振成像[5-8]、口腔超聲成像[5,6,9]及電子計算機斷層掃描成像[10-13]等.這些技術都可以檢測出舌體腫瘤病灶的具體位值和大致范圍, 但檢測出的腫瘤厚度與實際厚度會有偏差, 并且在手術中也無法做到實時引導, 這就常常會導致手術切除不徹底, 從而引起腫瘤復發, 并且上述方法的檢測流程均較為復雜, 設備也比較昂貴.

BIS技術是向生物體注入安全的多頻激勵電流, 以一種低頻到高頻的掃頻方式采集生物組織不同頻率下的阻抗信息, 通過提取頻譜中有效的電學參數來定量分析生物組織的電學特性[14].BIS是能定量分析, 使用便捷及具有醫學應用前景廣泛的檢測技術, 如Yao等[15]采用BIS技術對單細胞的電學特性與其結構之間的關系進行了研究, 根據細胞的單、雙殼模型理論提出了不同種類細胞的電學模型; Mahdavi等[16]采用BIS技術對從乳腺癌手術中切割下來的新鮮組織進行阻抗的掃描和分析, 提出了一種新的乳腺病變病理評分的電學模型; Chen等[17]從醫學角度評價了BIS技術在乳腺癌保乳手術中對切緣腫瘤細胞是否殘留進行快速定性的有效性, 其結果顯示BIS檢測的結果與冷凍切片活檢的一致性較高, 對乳腺癌保乳手術中的切緣樣本是否含有癌變組織的定性檢測具有較高準確性, 可以適用于術中的快速判斷.此外BIS是功能性成像, 癌細胞相較于正常細胞有諸多的特性[18], 會產生與正常組織不同的電學信號, 因此可以用BIS技術檢測舌體中正常和癌變舌組織, 提取出兩種組織的相異電學信息進而區分舌組織癌變區間.

本研究用人舌鱗癌細胞系(HSC3)培養了不同腫瘤體積的癌變舌體, 用現有的BIS檢測設備對舌體舌尖、舌中、舌根3個部位的舌組織掃頻檢測, 之后用蘇木精-伊紅染色法(HE染色)確定舌部腫瘤的具體位置, 根據HE染色結果對照研究舌體中腫瘤組織區域、混有腫瘤組織區域及正常組織區域的電學特性, 最終從BIS中提取出frelax,3個電學參數對這3種舌組織進行定量分析.

2 實驗設備及方法

2.1 實驗設備

本實驗以HSC3癌變舌體為被測對象.圖1(a)給出了實驗設備原理圖: 1臺PC機、1臺阻抗分析儀(IM3570)、1個培養皿、1個四電極傳感器.圖1(b)是四電極傳感器的結構圖, 是由4根鍍金電極和1個樹脂外殼組成.鍍金電極的直徑為0.5 mm, 間隔1.6 mm; 樹脂外殼直徑為12 mm,長為31 mm, 由3D打印機打印而成.將傳感器置于比色皿中的舌體進行測量, 傳感器的4根鍍金電極通過4條屏蔽線連接到阻抗分析儀上.阻抗分析儀捕獲探頭發出的信號后, 將測量數據傳輸給PC機進行后續的處理.

圖1 BIS檢測儀器 (a) 阻抗分析儀及傳感器; (b) 四電極傳感器結構圖Fig.1.Measuring equipment of BIS: (a) Impedance analyzer and sensor; (b) structure diagram of four-electrode sensor.

2.2 HSC3舌體腫瘤制備

為了比較舌體腫瘤與正常舌組織的電學特性,參照文獻[19]制備了原位HSC3舌體腫瘤.HSC3細胞培養使用了10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養基, 置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養.準備4只Balb/c-nude雌性小鼠, 當細胞培養完成后, 在其中3只小鼠麻醉狀態下注射1 × 106細胞數量的HSC3細胞于每只小鼠的舌尖部位.每日觀察小鼠舌尖并用游標卡尺測量腫瘤的長和寬, 然后用公式(V=(L×W2)/2, 其中L是腫瘤的長度, W是腫瘤的寬度)計算其大致體積.待腫物形成后, 用頸椎脫臼法處死麻痹狀態下的小鼠, 最后切取小鼠的舌體置于磷酸緩沖鹽(PBS)溶液中以便備用.

2.3 實驗過程

準備兩個培養皿, 用鑷子將4只小鼠的舌體夾入其中1個培養皿以待檢測, 并往培養皿中倒入PBS溶液以保持舌組織的活性.采用四電極法測量組織的阻抗譜, 用幅值I = 10 mA的交流電對其激勵, 采集其兩端的電壓信號, 掃頻范圍為100 Hz—5 MHz.將標記好的舌體依次放入另1個培養皿中快速檢測, 將四電極傳感器對準舌尖的中線, 依次插入舌尖、舌中和舌根3個部位的表層組織, 深度約1 mm, 每個部位采集3次.掃頻完成后保存實驗數據, 將舌體夾回原培養皿中進行下1個舌體的檢測.對每個部位3次采集的數據取平均值進行數據處理分析, 最終將所有舌體放入組織固定液中以便之后的染色處理.

2.4 HE染色

沿著舌體中線進行切片處理, 切片組織用95%乙醇固定20 min, 之后用PBS溶液洗滌, 每次1 min.洗滌后用蘇木素染液對切片組織中細胞的細胞核染色, 染色2—3 min后用流水沖洗.然后通過顯微鏡觀察, 如果細胞核染色過深, 用1%鹽酸酒精溶液分色數秒, 之后用流水沖洗.分色之后用伊紅染液對貼片組織中細胞的細胞質染色, 染色1 min后用流水沖洗.最后自然晾干切片組織并用中性樹膠封片.

3 實驗結果與討論

3.1 HE染色結果

本文把含有HSC3腫瘤的舌體分為正常組織區域(N)、混有腫瘤組織區域(B)、腫瘤組織區域(T).圖2給出了4只小鼠(正常舌體, Mou1, Mou2,Mou3)舌體的HE染色結果, 圖中由黃色虛線圈出的細胞密集、顏色為深紫色的區域為HSC3腫瘤所在的大致位置, 從染色圖可以清楚地看到正常舌體中并無HSC3腫瘤, Mou1, Mou2和Mou3的舌尖部位有HSC3腫瘤.為了對照研究3塊區域的電學特性, 后文將以正常舌體和Mou1的HE染色結果作為對照.

圖2 舌體的HE染色圖Fig.2.HE staining of tongue.

3.2 BIS檢測結果

圖3 給出了4只小鼠舌體的幅值頻譜, 首先從HSC3癌變舌體(Mou1, Mou2, Mou3)的幅值頻譜可看到, N, B, T 3塊區域組織的阻抗幅值變化趨勢都是一樣的, 但是在各個頻點上阻抗幅值大小不同, 唯有N區域的阻抗幅值一直保持最小.由實驗結果可知: 當log(f ) ＜ 5.907 (f ＜ 8.09 ×105Hz)時, 3塊區域的阻抗幅值在一直減小.因為低頻時組織的阻抗成分中容抗成分是主導成分, 隨著頻率的提高阻抗值會不斷減小, 而且3個區域組織的阻抗譜有交叉, 并不能很好地區分這3類組織;當log(f ) ＞ 5.907 (f ＞ 8.09 × 105Hz)時, 隨著頻率的升高, 感抗成分是主導成分, 隨著頻率的提高阻抗值又轉而增大, 而且3塊區域的阻抗譜無交叉, 可很好區分.在頻率f為100—8.09 × 105Hz的范圍內, 3個區域組織的阻抗譜有交叉, 是因為電流注入電極時, 電極與組織溶液界面會產生接觸阻抗從而影響測量結果.根據復系數ξ=ξRe+ξIm(ξ為接觸阻抗效應比; ξRe, ξIm分別為電阻抗實部和虛部的接觸阻抗效應比)可以定量地評價接觸阻抗的影響, ξRe和ξIm隨頻率而變化, 在低頻段f ＜100 kHz時的ξRe遠遠大于f ＞ 100 kHz時的ξRe,同樣在低頻段f ＜ 100 Hz時的ξIm遠遠大于f ＞100 Hz時的ξIm[20].那么在低頻段的ξ必然也遠遠大于高頻段的ξ, 即低頻段的接觸阻抗效應遠遠大于高頻段, 隨著頻率不斷提高, 接觸阻抗的影響會越來越小, 測量的阻抗幅值也就越來越準確.因此可以用0.8 MHz以上的頻段對N, B, T 3塊區域組織定量分析來區別這3類組織, 同時計算了該頻段其阻抗幅值的最大相對誤差(相對誤差公式為:如表1所列.另外, 舌體本身不是前后對稱的, 舌體各個位置的厚度、味覺感知等均有區域化差異, 可能對舌體的阻抗值大小有影響, 從正常舌體3個位置的幅值頻譜可以看到,當log(f ) ＞ 5.907時, 正常舌體3個部位的阻抗值大小接近, 因此可以排除舌體不同位置的細胞差異導致其阻抗值變化的影響.

圖3 舌體的幅值頻譜Fig.3.Amplitude spectrum of tongue.

表1 阻抗測量值的最大相對誤差Table 1.Maximum relative error of impedance value.

3.3 HSC3癌變舌體中不同區域組織的定量分析

圖4是HSC3癌變舌體高頻段(頻率范圍為2—5 MHz)的阻抗頻譜.當舌部表層組織被激勵時會產生電場, 表層組織受到電場力的作用下首先會發生表面極化, 隨著頻率不斷提高, 舌內部的細胞會發生電荷極化、分子極化.當舌部正常區域發生癌變時, 其組成細胞不管是分子結構還是生理功能都發生了巨大改變.那么隨著頻率提高, 正常細胞和癌細胞從1個平衡狀態轉到另1個平衡狀態所需的弛豫時間必定不同, 那么弛豫頻率frelax也就不同.因此可以用弛豫頻率frelax和frelax對應的電阻抗值的實部和虛部對3種區域的組織進行定量分析.

以圖4 (Mou1)為例, T區域在弛豫頻率fT=3.46 × 106Hz處的阻抗值實部= 409 Ω, 阻抗值虛部= 618 Ω; B區域在弛豫頻率fB=3.31 × 106Hz處的阻抗值實部= 294 Ω, 阻抗值虛部= 443 Ω; N區域在弛豫頻率fN=3.17 × 106Hz處的阻抗值實部= 208 Ω, 阻抗值虛部= 334 Ω.圖4 (Mou2和Mou3)也有同樣的規律, 無論是從電阻抗值的實部Z' 頻譜還是Z''虛部頻譜, 都可以看出N, B, T3塊區域的frelax,和的值明顯不同, T區域的這3個參數值最大, N區域的值最小.腫瘤組織的阻抗值大于正常組織, 是因為癌組織內的癌細胞無限繁殖, 細胞排列緊密, 又由于癌組織中的癌細胞需要快速分裂繁殖, 這樣癌細胞就需要大量的自由水來促進新陳代謝, 使得癌組織的阻抗值提高.自由水的弛豫可能出現在109—1010Hz的微波領域的不同位置, 相較于細胞、生物大分子等物質體系而言, 自由水的弛豫頻率更高.因而含有大量自由水的癌組織的弛豫頻率也相對較高.

圖4 HSC3癌變舌體的阻抗頻譜 (a) 電阻抗實部Z′頻譜; (b) 電阻抗虛部Z′′頻譜Fig.4.Impedance spectrum of tongue with HSC3 canceration: (a) Real part spectrum of electrical impedance; (b) imaginary part spectrum of electrical impedance.

圖5 把3種舌組織阻抗頻譜中的frelax,和提取出來進而對這3種舌組織區分.正常組織的平均frelax= 3.12 × 106Hz, 平均=197 Ω, 平均= 311 Ω; 混有腫瘤組織的平均frelax= 3.26 × 106Hz, 平均= 269 Ω, 平均= 408 Ω; 腫 瘤 組 織 的 平 均frelax= 3.38 ×106Hz, 平均= 360 Ω, 平均= 540 Ω.為了識別檢測的組織是否是腫瘤組織, 根據這3種組織的平均和值定義了組織癌變系數α=和其 中分別為弛豫頻率下待測組織與正常組織之間阻抗實部與虛部的變化量.用α和β兩個系數綜合評價被檢測組織, 當= 36.5%,=31.2%時, 組織是正常組織; 當α ≥ 36.5%, β ≥ 31.2%時, 組織可能混有腫瘤組織; 當= 82.7%,=73.6%時, 組織是腫瘤組織.

圖5 HSC3癌變舌體組織電學特性對比 (a)弛豫頻率 frelax對比; (b)電阻抗實部 對比; (c)電阻抗虛部 對比Fig.5.Comparison of the electrical characteristics of tongue tissue in HSC3 canceration: (a) Comparison of frelax; (b) comparison of (c) comparison of

4 結 論

根據HE染色結果用BIS方法對小鼠HSC3癌變舌體的正常組織區域、混有腫瘤邊組織區域和腫瘤組織區域進行了電學特性研究, 發現腫瘤組織區 域高 頻 段 的frelax,和值 明顯 高于 正 常組織區域, 本文根據這3個電學參數定義癌變組織系數α與β進行腫瘤組織識別, 結果表明, 當α ≤36.5%, β ≤ 31.2%時, 組織是正常組織; 當α ≥36.5%, β ≥ 31.2%時, 組織可能混有腫瘤組織;當α ≥ 82.7%, β ≥ 73.6%時, 組織是腫瘤組織.本方法無需樣品預處理, 可以直接檢測舌表層組織, 操作簡單, 為后續舌體腫瘤組織邊界的確定做基礎.因此, 本方法可以應用于舌體腫瘤切除的臨床研究中, 為非侵入式、快速、便捷地檢測出舌體腫瘤邊界以利于主刀醫師徹底切除舌體腫瘤提供一種新的檢測方法.

感謝南京市口腔醫院口腔頜面外科宋傳慧博士提供的技術支持.