牛至生殖生物學特性研究

劉 艷，卓 維，盧圣鄂，朱曉富，辛元堯，申 杰，黃紅燕，任風鳴

(重慶市藥物種植研究所 特色生物資源研究與利用川渝共建重點實驗室，重慶 南川 408435)

牛至(OriganumvulgareL.)隸屬于唇形科(Lamiaceae)牛至屬(Origanum)，多年生草本或半灌木，芳香，產河南、江蘇、浙江、安徽、江西、福建、臺灣、湖北、湖南、廣東、貴州、四川、云南、陜西、甘肅、新疆及西藏，生于路旁、山坡、林下及草地，海拔500～3 600 m，歐、亞兩洲及北非也有分布，北美亦有引入[1]。牛至是一種重要的經濟植物，在西班牙、墨西哥和地中海地區的飲食中被作為香料長期使用[2]，在中國作為一味傳統的中草藥，用于預防流感，治療急性胃腸炎、腹痛、小兒食積腹脹等癥[1,3]。從牛至中提取的牛至精油具有良好的抑菌消炎、抗氧化等作用，能較好地促進動物生長、提高動物機體免疫力，且不具有耐藥性，是一種理想的抗生素替代品，已是世界范圍內公認的天然飼料添加劑[4-7]。

由于牛至精油的重要作用，目前對于牛至的研究多集中于牛至精油成分及活性[7-13]、次生代謝產物生物合成[14]、引種栽培技術[15-17]、擴繁技術[18-20]等方面。國內牛至生產中，主要通過野外收集種子或采挖野生植株作種[15]，缺乏統一純化的良種，栽培品種退化嚴重[19]。這致使牛至人工種植規模小，產量不穩定，質量參差不齊，嚴重限制牛至的生產發展[21]。對植物生殖特性及繁育系統的了解是進行良種選育、雜交育種及可持續利用的基礎，而當前針對牛至生殖特性的研究報道較少。已有研究大多僅關注到牛至開花生物學特性[22-24]，對其繁育系統的研究還很匱乏。本研究重點開展了牛至花粉活力、柱頭可授性及繁育系統的研究，探索其生殖生物學特性及繁育系統特征，旨在提高牛至繁殖效率，為良種選育、雜交育種等提供理論依據，對于推動牛至資源可持續利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用牛至均為野外采集新鮮植株，采自云南省麗江、大理等地，在種質資源圃栽種一年，開花時經重慶市藥物種植研究所劉正宇研究員鑒定為牛至OriganumvulgareL.。根據Ietswaart[25]牛至屬的分類系統，牛至包含6個亞種，我國分布有OriganumvulgareL. ssp.vulgareL.和OriganumvulgareL. ssp.viride(Boissier) Hayek兩個亞種。根據牛至亞種檢索表[25]，這兩個亞種的主要鑒別特征為：O.vulgaressp.vulgare苞片紫色、花粉紅色；O.vulgaressp.viride苞片綠色、花白色。本研究中試驗材料為苞片綠色、花白色的牛至亞種，此亞種為O.vulgaressp.viride。

本研究試驗主要在重慶市藥物種植研究所的牛至種質資源圃中開展，物候觀察及結實率統計還包括牛至的野外采集地。于2019年10～11月和 2020年4～10月進行開花、結實物候觀察及結實率統計，2020年4～8月進行花粉、柱頭可授性測定及人工控制授粉試驗等。

1.2 研究方法

1.2.1 花期物候及形態學觀察

從2020年4月1日開始，每3 d觀察1次現蕾情況?，F蕾之后，隨機選取5株植株進行標記，每天觀察其形態特征并記錄開花順序、初花、盛花、末花及結實時間等。同時標記即將開放的10朵花蕾，定位觀察單花水平的開花進程，觀測記錄花的狀態、雌雄蕊的變化等，并測量花冠長度、直徑、雌雄蕊高度等。

1.2.2 花粉活力及柱頭可授性檢測

于盛花期隨機采集開花前不同大小及開花后不同天數的新鮮花朵，每個階段5朵左右，取其花粉進行活力檢測。將少量花粉置于載玻片上，滴1～2滴0.5% TTC溶液，充分混勻后蓋上蓋玻片，置于35 ℃恒溫箱中15 min，之后在Nikon eclipse 55i顯微鏡下觀察計數。選取5個視野，每個視野花粉數約為70～130粒不等，凡被染成紅色的花粉為具有活力的花粉，淡紅色或無色者視為不具有生活力的花粉?；ǚ刍盍?%)=紅色花粉數÷花粉總數×100%。

采用聯苯胺-過氧化氫法檢測不同開花時期柱頭的可授性。隨機選取開花前不同大小及開花后不同天數的新鮮花朵，每個階段5朵左右。在凹面載玻片中加入體積比為1%聯苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22的反應液，將待檢柱頭浸入其中，在Nikon eclipse 55i顯微鏡下觀察柱頭是否呈現藍色并產生大量氣泡，如柱頭呈現藍色并產生大量氣泡為具活力的柱頭，不呈現藍色并且不產生氣泡的為不具活力的柱頭，同時根據氣泡的多少來衡量柱頭可授性的強弱。

1.2.3 雜交指數(Outcrossing index，OCI)的估算

按照Dafni的標準[26]進行花朵直徑、花朵大小、開花行為的測定及繁育系統的評判。①花朵或花序直徑：<1 mm賦值為0，1～2 mm賦值為1，2～6 mm賦值為2，>6 mm賦值為3。②花藥開裂時間與柱頭可授期之間的時間間隔：同時或雌蕊先熟賦值為0；雄蕊先熟賦值為1。③柱頭與花藥的空間位置：同一高度賦值為0；空間分離賦值為1。以上三者之和為雜交指數(OCI)。OCI=0時，繁育系統為閉花受精；OCI=1時，為專性自交；OCI=2時，為兼性自交；OCI=3時，為自交親和，有時需要傳粉者；OCI=4時，為部分自交親和，異交，需要傳粉者。

1.2.4 花粉胚珠比

隨機選取5朵花藥未開裂的花。將1朵花中所有的花藥置于EP管中，加200 μL染液，將花藥搗碎使花粉散出成為懸濁液，在渦旋儀上震蕩60 s，然后取5份1 μL的樣本于載玻片上，于Nikon eclipse 55i顯微鏡下觀察計數，取平均值。1朵花中總的花粉數=1 μL樣本中的花粉數×200。將同一朵花的子房在Nikon eclipse 55i顯微鏡下觀察記錄胚珠數?；ǚ叟咧楸?P/O)=花粉數/胚珠數。根據Cruden的標準[27]進行繁育系統的判斷：P/O為2.7～5.4，繁育系統為閉花受精；P/O為18.1～39.0，為專性自交；P/O為31.9～396，為兼性自交；P/O為244.7～2 588，為兼性異交；P/O為2 108～195 525，為專性異交。

1.2.5 繁育系統檢測

為檢測其繁育系統，于盛花期隨機選取即將開放的花朵，開展6個試驗處理：①不去雄，不套袋：作為自然對照。②去雄，套袋，不授粉：檢測是否具有無融合生殖。③不去雄，套袋：檢測是否具有自發的自花授粉。④去雄，套袋，人工自花授粉：檢測自花自交情況。⑤去雄，套袋，人工同株異花授粉：檢測同株異花自交情況。⑥去雄，套袋，人工異株授粉：檢測異交情況。

全部人工控制授粉試驗均提前進行去雄操作并標記好，然后用6 cm×6 cm孔徑為0.1 mm的尼龍網袋將所在花序套住，待柱頭張開具可授性之后打開網袋完成人工授粉后繼續套住。授粉時選取完整沒有開裂的花藥，取其中花粉進行授粉。自然對照及其余每個處理幾十至一百多朵花不等，7～8周后統計結實率。因其每朵花4個胚珠可結4個堅果，因此其結實率(%)=果實數÷花數÷4×100%。

1.3 數據統計分析

試驗數據采用Excel 2003和SPSS17.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 開花物候和形態學

O.vulgaressp.viride花序為傘房狀圓錐花序，多花密集(圖1，A)；苞片長圓狀倒卵形，綠色，長約5 mm；花萼鐘狀，長3 mm；花冠白色，管狀鐘形，長約7 mm，冠檐二唇形，上唇直立，2裂，下唇張開，3裂(圖1，B)；花冠管底部分泌有微量花蜜；雄蕊4，后對短于上唇，前對略伸出花冠；柱頭先端不相等2淺裂，裂片鉆形(圖1，F)。果熟時果序棕褐色，小堅果卵圓形，棕色。

O.vulgaressp.viride的花期出現在2020年4月至8月，其中5月中下旬至7月中下旬為盛花期。定位觀察結果顯示，O.vulgaressp.viride于4月10日左右現蕾，4月27日開始開花，8月陸續開始結實，8月底已沒有開花花序。同一花序上的花隨機開放。單花花期6～8 d左右，花朵大約在上午9～12時開放，最初是從上下唇連接處開裂，然后下唇逐漸張開。隨著花柱的伸長，柱頭在花開放后的24～48 h逐漸伸出花冠外張開。雄蕊在花開放后的1～2 d逐漸伸出花冠外?；ǘ溟_始凋謝時花冠出現棕色斑塊，雌雄蕊逐漸變為棕色，最后花冠全部變成棕色，整朵花萎縮(圖1，D)，花冠脫落，花萼宿存。

圖1 Origanum vulgare ssp. viride形態及訪花昆蟲Fig. 1 Morphologies and flower visitors of Origanum vulgare ssp. viride注：A.開花時花序形態；B.不同大小花的開放狀態；C.胚珠數量及形態(可見4個卵圓形胚珠)；D.花朵衰敗時的形態；E.MTT檢測的花粉形態；F.聯苯胺-過氧化氫法檢測的柱頭形態；G，H.昆蟲鉆入花朵中訪花。標尺：A，B，D=5 mm；C，F=500 μm；E=100 μm；G，H=2 mm。

2.2 花粉活力及柱頭可授性

經過觀察，O.vulgaressp.viride的花藥從開花第1天開始開裂散粉，持續到花朵枯萎(表1)。TTC檢測結果顯示，其花粉自蕾期花藥未開裂時即開始具有一定活力(花長3.0 cm以上)(表1)，經TTC染色后花粉粒呈現紅色(圖1，E)。隨著花朵的生長花粉活力逐漸增強，開花第1天花粉活力最高，達到(92.77±1.54)%，其花粉活力期持續時間長，并且保持較高的活力，直至第8天花朵開始枯萎時，仍具有(73.74±2.35)%的活力(表1)。

根據聯苯胺-過氧化氫法檢測結果(表 1)，O.vulgaressp.viride的柱頭裂片處于閉合狀態時不具有可授性，直至開花第2天柱頭裂片張開后才開始具有可授性(表1)，浸入聯苯胺-過氧化氫液體中柱頭周圍產生大量氣泡(圖1，F)。開花第1天柱頭裂片并未張開，此時不具可授性，開花第3～4天柱頭可授性較強，當花朵開始衰敗柱頭變枯黃時，有些柱頭仍具有一定可授性(表 1)。

表1 不同開花時期Origanum vulgare ssp. viride的花粉活力及柱頭可授性Table 1 The pollen viability and stigma receptivity of Origanum vulgare ssp. viride at different flowering periods

2.3 雜交指數(OCI)

O.vulgaressp.viride的花朵直徑約為3.5～4.9 mm，根據Dafni的標準[26]，賦值為2；其雄蕊先熟，花藥從開花第1天開始開裂散粉，而此時柱頭尚不具有可授性(表1)，賦值為1；開花時柱頭與花藥在空間位置上是分離的，柱頭位置高于較長的后對花藥約1.5 mm，賦值為1。因此，O.vulgaressp.viride的OCI值為4。根據Dafni的標準[26]，其繁育系統為部分自交親和，異交，需要傳粉者。

2.4 花粉胚珠比

試驗結果顯示，O.vulgaressp.viride單花花粉數為9 816±203，單花胚珠數為4(圖1，C)，其花粉胚珠比(P/O)為2 454.00±50.85。依據Cruden的標準[27]，其繁育系統為兼性異交或專性異交。

2.5 繁育系統

自然對照和人工控制授粉試驗結實率情況見表2。自然狀態下，O.vulgaressp.viride野外居群的結實率較高，麗江居群和大理洱源居群的結實率分別為(45.36±5.51)%和(41.24±4.60)%，而種質資源圃中的結實率較低，僅為(4.17±1.80)%。去雄套袋后并未結實，說明其不存在無融合生殖現象。人工自花、同株異花和異株授粉均能結實，異交的結實率高于自交結實率(表2)。不去雄、套袋的結實率為0，說明其不能自動自花授粉，需要借助傳粉媒介完成授粉。綜合雜交指數和花粉胚珠比的試驗結果來看，O.vulgaressp.viride的繁育系統為兼性異交，部分自交親和，需要傳粉者。

表2 Origanum vulgare ssp. viride自然和人工控制授粉結實率Table 2 Fruit set ratio of Origanum vulgare ssp. viride under natural and manipulated treatments

3 討 論

O.vulgaressp.viride花朵開放時間為上午9～12時，單花花期6～8 d，這與Zimina對生長于莫斯科地區牛至的開花生物學研究[22]結果相一致。Zimina還發現單花花期最長的可達37 d[22]，在觀察過程中尚未發現O.vulgaressp.viride開放時間這么久的花朵。而Godin對莫斯科地區牛至的觀察結果表明兩性花的花期為2～3 d，Godin認為單花花期會在不利環境條件下延長以延長昆蟲授粉時間[23]。

有些地區的牛至具有雌全異株現象[1,23-24]，據研究觀察結果O.vulgaressp.viride均為兩性花植株，未發現有雌性花植株。Godin研究發現牛至兩性花的開花進程分為雄性階段和雌性階段，開花時花藥開裂，此時雌蕊不具功能，為雄性階段；在開花30～35 h后柱頭裂片張開，雌性階段開始，此后花藥干燥，雄性階段結束[23]。根據檢測結果，O.vulgaressp.viride的開花進程不能區分為雌、雄兩個階段，雖然也是雄蕊先熟，但是雌蕊具功能之后雄性功能并未結束，直至花朵枯萎花粉仍具有較高活力(表1)。

對花粉活力和柱頭可授性的研究是有性生殖研究的基礎，在育種過程中理想親本最佳生殖期不相遇是影響雜交的主要因素，因此需要全面了解認識親本的物候期，準確把握最佳授粉時間[28]。研究結果顯示，O.vulgaressp.viride柱頭可授期與花粉活力期同期且持續時間都較長(表1)。因此，在育種工作中可以在花開前后十余天的時間里開展人工授粉或收集花粉進行保存，為了保證授粉成功率，盡量選取花粉活力高的時間段采集花粉。同樣，應選用可授性強的柱頭進行授粉以提高成功率。

O.vulgaressp.viride的雜交指數為4，依據Dafni的標準[26]其繁育系統為部分自交親和，異交，需要傳粉者；其花粉胚珠比為2 454.00 ± 50.85，依據Cruden的標準[27]它的繁育系統為兼性異交或專性異交；人工控制授粉試驗結果顯示其自交、異交均可結實，不能自動自花授粉，需要借助傳粉媒介。綜上而言，三種方法檢測的繁育系統結果一致，其繁育系統為兼性異交，部分自交親和，需要傳粉者。

牛至的傳粉昆蟲種類較多，有蜜蜂、蜂虻、蝶類、熊蜂等[22,29]。觀察結果顯示在O.vulgaressp.viride種質資源圃中沒有上述傳粉昆蟲，只有螞蟻(圖1，G)、蠅類(圖1，H)等少量昆蟲。Zimina研究發現牛至除蟲媒外還能進行風媒傳粉[22]。風媒花常具有單性、花被片高度退化、無花蜜、花粉量大、花絲長、花粉粒光滑易于被風吹走等特點，蟲媒花通常小型、有香味和花蜜[30]。根據花部形態，O.vulgaressp.viride符合蟲媒傳粉綜合征，其去雄、不去雄套孔徑0.1 mm的網袋后均不結實，自然結實率很低(4.17±1.80)%，表明其尚未呈現風媒傳粉現象。

O.vulgaressp.viride野外居群結實率高，而種質資源圃中的結實率總體而言較低(表2)。推測造成結實率低的原因主要為：①引種栽培地環境條件(氣溫、光照、降水等)不如原生地適宜，影響了其開花結實過程。②花粉限制通常會影響結實率[31]，種質資源圃搭建了遮蔭棚等設施，遮擋影響了昆蟲訪花，傳粉昆蟲缺乏使得授粉率不高，導致結實率較低。因此，在實際生產中采挖栽培時應選取生境氣候相似的地區作為種植地，另外要建立有效的傳粉機制，如增加傳粉昆蟲、人工輔助授粉等以提高結實率。

為了保證物種的繁衍，植物往往會發展出無性繁殖和有性繁殖并存的生殖補償機制。O.vulgaressp.viride即是一種兼具有性繁殖和無性繁殖的物種，當生境條件惡劣、缺乏傳粉昆蟲等使其有性繁殖過程不能順利進行時，它能以根莖的無性繁殖保持其種群繁衍的能力。當前生產中應用廣泛的分株繁殖方式就是利用其根莖的無性繁殖特性。但長期無性繁殖會導致品種退化、病蟲害嚴重等問題，影響其產量和質量。要解決這些問題，應該多采用有性繁殖方式，利用種子播種進行育苗種植，并利用雜交育種技術選育優良品種。

綜上所述，牛至是一種重要的天然“抗生素”植物，是無抗飼料添加劑的主要原料之一。本文對中國產牛至亞種O.vulgaressp.viride的物候期、有性生殖特性、繁育系統特征等進行了深入研究探討，對指導國內實際生產應用中科學引種種植、人工輔助授粉等具有重要的意義，同時也為牛至的繁殖栽培及雜交育種工作提供依據和參考，助推牛至產業發展。