基于原子力顯微鏡壓痕技術的大鼠小梁網組織彈性模量測定

王川 李林 劉志成

0 引言

青光眼是全球第一大不可修復的致盲眼病，患病率已超過人口總量的3.5%。到2040年，全球患者總數將達到1.1億，是全球關注的重大健康問題之一[1]。眼球是密閉的腔體，眼內房水異常堆積將導致眼壓升高[2-3]。小梁網房水排出通道是房水外流的主通道，約80%以上的房水經小梁網通道排出[4]。小梁網的組織力學特性與小梁網的組織結構以及房水流出阻力密切相關[5-6]。因此小梁網組織(trabecular meshwork,TM)力學特性的認識對了解高眼壓狀態下房水流出阻力增加具有重要意義[7-8]。

小梁網組織內嵌于前房角處的鞏膜區域，小梁網組織位置特殊，幾何尺寸小且組織分離難度大。對于小梁網組織目前尚無成熟的生物力學測試方法。在已有的大、小鼠小梁網組織力學特性研究中，直接測量小梁網組織力學特性主要用到2種方法，即單軸拉伸實驗(uniaxial tensile test)與原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)壓痕實驗[9-10]。前者需要剝離小梁網組織，實驗難度大且破壞了其原生理狀態，獲取的是垂直于房水流出方向的組織力學特性[11]。相比較而言，AFM壓痕實驗更接近小梁網組織的生理狀態且獲取的是沿房水流出方向的組織力學特性。然而，由于鞏膜組織的非透光性導致其在光學顯微鏡下成像效果極差，極難分辨確切的小梁網組織部位，而AFM壓痕實驗裝置需要搭載光學顯微鏡進行組織部位的確定，導致了AFM壓痕實驗無法準確定位小梁網組織測試區域的實際困難。目前，Huang等[10]采用Evans藍染料進行前房灌注用于標記大鼠小梁網組織，結合AFM壓痕實驗獲取的大鼠小梁網組織彈性模量為162 Pa，該研究中Evans藍染料并不特定作用于小梁網，因此基于染色的方法確定小梁網組織測試區域存在著不確定性。Wang等[5]采用眼球冷凍組織切片，將切片后的組織進行AFM壓痕實驗獲取了小鼠小梁網組織的彈性模量為3 840 Pa，該研究中組織切片對小梁網組織的整體結構及力學特性均會產生一定的影響。這兩項研究均未給出大、小鼠小梁網組織在AFM測試環境下的位置、寬度信息以供后續研究做重要參考。

明確AFM測試環境下大鼠小梁網組織測試區域并準確定位，是獲取小梁網組織力學特性的關鍵前提。探索基于原子力顯微鏡壓痕技術獲取大鼠小梁網組織彈性模量的方法，為揭示小梁網組織力學特性與小梁網通道房水外流阻力之間的關系等研究奠定基礎?；谝陨戏治?，本研究基于大鼠眼球組織切片呈現的小梁網組織與毗鄰組織之間的位置關系、距離信息和結構信息基礎上，探索基于AFM壓痕實驗定位小梁網組織區域并獲取該組織彈性模量的測試方法，并利用該方法獲取了大鼠眼球鼻側、顳側、上側、下側4個位置處的小梁網組織彈性模量，也為即將進行的小梁網組織力學特性與小梁網通道房水外流阻力之間的關系等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

首都醫科大學實驗動物中心提供的正常 8～10周雄性SD大鼠10只，無眼部疾病，眼壓正常，體質量240～280 g。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，按體質量1 mL/100g劑量給藥，深度麻醉后脫頸處死。眼科剪剪開結膜，剪斷視神經，完整取出眼球，分別進行標號。分離了共20只眼球用于實驗測試。選取其中4只眼球區分左右眼用于組織學切片及染色處理，另外的16只眼球區分左右眼用于AFM壓痕實驗，其中4只眼球用于確定AFM測試環境下小梁網組織測試區域，另外12只眼球區分左右眼用于小梁網組織環周力學特性測試。所有實驗和流程符合首都醫科大學使用動物的聲明。

1.2 實驗過程及數據處理

1.2.1 組織切片染色

小梁網組織內嵌于角鞏膜緣部位的鞏膜區域?？紤]到前房角處角膜組織富含膠原纖維，小梁網組織富含肌纖維，這兩種組織經過Masson染色后可以清晰地呈現出藍色和紅色的分布。因此，為了獲取小梁網組織與毗鄰組織之間的位置關系、距離信息和結構信息，實驗采用石蠟切片，Masson染色處理。垂直于虹膜縱向刨開眼球，切片厚度3 μm，每個眼球切片數量約30片，使用Zeiss(Axio Lab A,德國)顯微鏡進行組織切片觀察并給出大鼠小梁網組織與毗鄰組織之間的距離信息和結構信息，為AFM壓痕實驗提供數據支持。

1.2.2 AFM力學測試

本實驗利用NT-MDT公司生產的NTEGRA原子力顯微鏡，懸臂梁的彈簧系數k=0.04 N/m，球形壓頭的材質為氮化硅材料，壓頭半徑17 μm。AFM測試軟件為NovaPx軟件(NT-MDT，莫斯科，俄羅斯，version 3.2.5)。

實驗前進行預加載/調零。將大鼠眼球沿垂直于角膜方向剖開，去除眼球內容物。在操作顯微鏡下利用鑷子將虹膜撕下。沿角膜、鞏膜方向裁條。AFM壓痕實驗環節，將試樣自然平鋪在直徑為30 mm培養皿中。如圖1(a)所示，用3M膠帶分別將角膜和鞏膜部位與培養皿基底粘在一起，樣品制備過程中應避免樣品的擠壓與拉伸。加入適量PBS緩沖液沒過樣品組織，置于倒置顯微鏡上方，進行AFM壓痕實驗如圖1(b)所示。實驗過程中，在靠近角鞏膜緣的角膜部位，實驗中選了5個間隔20 μm的點分別進行AFM壓痕實驗，獲取了角膜的力-位移曲線，直至探針位置移動到角鞏膜緣的上方，這個位置在光學顯微鏡下可以分辨。實驗繼續采用逐點(間隔20 μm)測量的方法，探針逐漸移動到小梁網區域，從力-位移曲線的斜率可以看出這一變化。此處力-位移曲線將變得平緩(相對于角膜部位組織的力-位移曲線)，此時可以縮小測量的間距(間隔10 μm)，每個點進行測量。直至測量進入鞏膜區域，獲取鞏膜區域的力-位移曲線。

圖1 基于AFM壓痕實驗制備的大鼠角膜、小梁網、鞏膜組織樣品Figure 1 The cornea，TM and sclera of rats were prepared based on AFM indentation test

1.2.3 力-位移曲線的擬合方法

本實驗采用球形針尖，針尖曲率半徑為17 μm，壓入深度為2 μm，對于大鼠小梁網組織，滿足附于剛性基底的半無限Hertz模型[12-13]：

式中：F/nN為針尖對樣品施加的作用力；R/nm為球形針尖的半徑；E/GPa為材料的彈性模量；v為材料泊松比，對于不可壓縮的生物組織泊松比取0.5；δ/nm為壓入深度。

坐標(a,b)為力-位移曲線中探針與樣品的接觸點。將實驗獲取的力-位移曲線進行Hertz公式擬合[14]，給出彈性模量的信息，擬合過程及數據結果如圖2所示，整條曲線為實驗獲取的力-位移曲線，紅色曲線為Hertz擬合曲線，δ表示壓入深度。

圖2 力-位移曲線及Hertz公式擬合Figure 2 Force-displacement curve and Hertz formula fitting

2 結果

2.1 組織切片的位置確定

Masson染色結果如圖3所示。Masson染色在眼組織主要有藍色、紅色、紫色分布，組織層次清晰可見，角膜組織膠原纖維為藍色，肌纖維為紅色。切片中可以分辨角膜后彈力層止端和鞏膜突位置，這2處位置中間為鞏膜內溝，參考人眼組織結構可以判斷這2處位置之間為小梁網組織區域。根據圖中標尺可以確定此處距離角鞏膜緣約200 μm，小梁網組織的寬度約80 μm。在這些位置信息的基礎上，進行不同組織的AFM壓痕實驗，并為AFM壓痕實驗環境下定位小梁網組織區域提供參考。

圖3 大鼠眼部組織Masson染色Figure 3 Masson staining of rat eye tissue

2.2 不同組織彈性模量變化

根據1.2.3節給出的力-位移曲線擬合方法確定組織彈性模量，以1號右眼眼球為例，沿角膜-角鞏膜緣-小梁網-鞏膜方向的彈性模量的變化趨勢與組織間相對位置的關系如圖4所示。由于小梁網組織彈性模量遠低于角膜及鞏膜組織，大鼠小梁網區域組織的彈性模量約為幾百Pa，因此AFM壓痕實驗確定的小梁網組織的寬度約80 μm。對比眼球組織切片所獲取的小梁網組織寬度信息，AFM壓痕實驗所獲取的小梁網組織寬度信息與組織切片觀察的結果具有一致性。

圖4 AFM壓痕實驗獲取的角膜到鞏膜區域的彈性模量Figure 4 The elastic modulus of cornea to sclera region obtained from AFM indentation

2.3 AFM力學測試環境下小梁網區域位置的確定

AFM壓痕實驗過程中記錄出現小梁網處組織彈性模量變小時，探針所處的位置為距離角鞏膜緣處約200 μm。角鞏膜緣在鏡下比較容易辨認。如圖5所示，上方第一條黑色水平直線即角鞏膜緣的位置，該直線下方的平行線所示位置為小梁網區域的上邊界。圖中兩條黑線中間的位置為角鞏膜緣至小梁網組織的過渡區域。參考懸臂梁的高度(200 μm)可以確定過渡區域寬度大約200 μm。此結果可為在AFM測試環境下快速定位小梁網組織測試區域提供依據。即沿著角膜-鞏膜的方向進行AFM壓痕實驗，當控制懸臂梁的底端與角鞏膜緣平齊時，結合懸臂梁的高度約200 μm，懸臂梁頂端針尖所對應的位置即是小梁網的開始測量點，以此位置開始約80 μm的跨角膜-鞏膜區域是小梁網組織的測試區域。

圖5 AFM壓痕實驗中大鼠小梁網部位的確定(×50)Figure 5 Determination of TM position in AFM indentation experiment(×50)

2.4 小梁網組織環周彈性模量結果

考慮到小梁網組織沿房角處的環向分布特點，小梁網組織的彈性模量在不同的部位(如鼻側和顳側)可能會有改變，因此，實驗中設計了每只眼球取4個部位進行力學測試，即鼻側、顳側、上側和下側4個互相對稱的位置。其中鼻側和顳側在取眼球之前用記號筆標記，垂直與鼻側和顳側連線方向就是上側和下側小梁網位置。實驗中將12只大鼠眼球按照沿著鼻、顳、上、下4個部位進行裁樣。裁樣環節由于操作不熟練，導致2只眼球無法用于AFM壓痕實驗，最終有10只眼球進行了AFM壓痕實驗，每只眼球測試部位為上、下、鼻、顳4個部位。結合AFM力學測試環境下小梁網區域位置的確定方法，對小梁網區域進行了AFM壓痕實驗，實驗中每處組織間隔測試5個點，間距為10 μm。將實驗獲取的力-位移曲線進行Hertz擬合給出彈性模量的數值。區分左右眼將10只眼球的鼻側、顳側、上側、下側4個部位的彈性模量以平均值±標準差的形式列于表1。

表1 大鼠眼部鼻側、顳側、上側、下側的小梁網組織彈性模量(n=5)Table 1 Values of elastic modulus of TM in nasal，temporal，superior and inferior sides of rat eyes(n=5)

采用Dunnett’s 多組間檢驗的方法，左右眼4個部位的小梁網組織彈性模量之間差異無統計學意義。該數據說明在小梁網組織的彈性模量在不同的部位沒有明顯改變，因而進行大鼠小梁網組織彈性模量測量的過程中，可以忽略小梁網組織不同位置處彈性模量的差異。

3 討論與結論

本研究探索了一種基于AFM壓痕技術定位大鼠小梁網組織并獲取該組織彈性模量的測試方法，基于該方法得到的大鼠小梁網彈性模量范圍為300～600 Pa。明確了大鼠小梁網組織測試區域寬度約80 μm。小梁網區域彈性模量結果與Huang等[10]報道的結果相近。Huang等利用前房灌注染料進行小梁網處組織的染色，然后利用AFM壓痕實驗對染色處的組織進行力學測試獲取的結果為162 Pa。該研究未考慮染料分子進入小梁網通路之后對組織力學特性所產生的影響，同時，該染料并不能特定地對小梁網組織進行染色，這使得在力學測試環節并不能準確定位小梁網組織。Wang等[5]報道了一種基于AFM壓痕實驗對CBA/J與C57BL/6J兩種小鼠小梁網組織彈性模量的測量方法，所得結果分別為3.84 kPa±3.37 kPa(n=7)和3.22 kPa±1.84 kPa(n=3)。所得彈性模量值要大于本研究的結果，他們提出了對小梁網測試部位具有一定的不確定性。

本研究同樣存在著局限性。首先，AFM測試環境下角鞏膜緣部位的確定存在著主觀性，需要進一步優化測試方法。其次，所得數據標準差較大，應進一步縮小測試的步長，進一步優化測試過程，這樣獲得的結果會更加準確。第三，對于小梁網組織不同部位的彈性模量結果，由于動物的個體差異及不同樣本間的結果存在差異，后續研究中可以通過加大樣本量，得到更加一致的結果。

基于AFM壓痕實驗獲取小梁網組織力學特性，其測試結果受到AFM針尖幾何形狀、針尖尺寸、檢測條件的設定、數學模型的應用等因素的影響。在每次測量的過程中，可以保證測試時的溫度、濕度保持相對穩定。因此誤差的來源可歸屬于系統誤差。系統誤差對測量結果的影響是一致的。因此，同批次的小梁網組織的測量結果之間具有可比性。本研究獲取的小梁網組織彈性模量值標準差較大，原因主要由小梁網組織結構分布的非均勻性所導致的，小梁網是由相互聯結的小梁組成的多孔網狀結構組織[15]，壓痕實驗中采集的5個點的數據，有的可能壓在小梁網組織孔洞較多的部位(結果偏小)，有的可能會壓在彈性纖維上(結果偏大)，因此，取平均之后，標準差會比較大。小梁網組織彈性模量與小梁網組織的細觀結構密切相關，需要進一步研究小梁網組織彈性模量的結構依賴性。

本研究基于大鼠眼球組織切片呈現的大鼠小梁網組織與毗鄰組織之間的位置關系，給出了一種基于AFM壓痕技術獲取大鼠小梁網彈性模量的測試方法。該方法提供了AFM測試環境下小梁網組織區域的位置參考，優勢在于可快速定位到大鼠小梁網組織區域。