光譜法測定電子煙液中的游離煙堿

黃延俊，方鉦中，張廷貴，黃華發*，韓書磊，葉劍良，藍洪橋，劉澤春，謝 衛

1.福建中煙工業有限責任公司技術中心，福建省廈門市集美區濱水路298號 361021

2.國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州高新技術產業開發區翠竹街6號 450001

3.廈門大學化學化工學院，福建省廈門市思明區思明南路422號 361005

煙堿結構中包含吡啶和吡咯兩個含N基團，因此在不同pH條件下存在3種形態：雙質子態、單質子態和游離態（圖1），解離常數p Ka1和p Ka2分別為3.12和8.02［1］。通常條件下，煙堿主要以單質子態和游離態形式存在［2］。煙堿形態與卷煙煙氣的刺激性顯著相關［3-4］，游離態煙堿容易穿透上呼吸道黏膜，產生強烈的生理感受或“擊喉感”［5］；質子態煙堿產生的感受平順，因此普遍認為含質子態比例高的煙氣煙堿容易進入呼吸道深處，給吸煙者帶來更強的生理滿足感［6］。隨著JUUL等電子煙產品的流行，為了提供與傳統卷煙相當的煙堿攝入量，電子煙煙液中煙堿的質量分數被提高至5%甚至更高［7］；與此同時添加于煙液中的有機酸（苯甲酸、乳酸、丙酮酸等）與煙堿生成鹽［8］，可調控煙堿形態。

圖1 煙堿的3種形態（雙質子態、單質子態和游離態）Fig.1 Nicotine in three forms:diprotonated,monoprotonated and free-base

利用煙堿的不同性質均可達到測定游離態煙堿（Free-base nicotine，FBN）的目的，比如通過測定煙草制品的pH，再經過Henderson-Hasselbach公式可快速換算FBN的質量百分比（αfbn）［9］。此外利用煙堿在水相-有機相或液相-氣相中的分配，液液萃取法［10-11］或SPME萃取法［12］也可實現游離態和質子態煙堿的分離，但操作較為繁瑣，且溫度和水分均會干擾測定結果［13］。文獻［2，14-15］中所使用的1H NMR方法是一種非破壞性手段，其通過煙堿吡啶環上Ha～Hd和吡咯環上甲基He的化學位移差，可計算得到αfbn。由于測試前不經過前處理，1H NMR方法可較為真實地反映電子煙煙液或煙氣中煙堿的形態分布。光譜方法較少應用于煙堿的表征，主要原因是煙堿分子結構中不帶有生色團，難以通過直接測量光譜獲得質量分數信息。為了更簡便直觀地表征電子煙液中的FBN，前期工作已應用可溶性的指示分子茜素紅S（ARS）開展FBN的測量［16］。由于該方法基于指示分子和煙堿分子中吡咯環N的親和性，指示分子與有機酸存在競爭關系，即指示分子的p Ka需滿足其與煙堿反應顯色的需要，又不影響業已形成的煙堿-有機酸絡合反應平衡。因此，本研究中選取結構相似但吸電子能力不同的溴甲酚綠（Bromocresol green，BCG，p Ka=4.24）［17］和氯酚紅（Chlorophenol red，CPR，p Ka=6.11）（圖2）［18］，比較了不同顯色分子與煙堿的親和性對電子煙液FBN測定結果的影響，并采用pH法和1H NMR法對結果進行比對驗證，旨在建立一種快速準確測定電子煙液FBN的方法。

圖2 溴甲酚綠（BCG）和氯酚紅（CPR）的分子結構Fig.2 Molecular structures of bromocresol green(BCG)and chlorophenol red(CPR)

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

16種商品化電子煙液樣品（表1）由福建中煙工業有限責任公司技術中心提供，包括裝填式和煙彈式，其中煙彈式經過破拆吸出煙液，有棉芯的取出棉芯后使用針筒擠出煙液。

表1 16種商品化電子煙液樣品信息Tab.1 Information of 16 commercial e-liquid samples

溴甲酚綠（95%）、氯酚紅（95%）、無水乙醇（HPLC級）、異丙醇（HPLC級）、1,2-丙二醇（99.8%）、丙三醇（99%）和DMSO-d6（99.8%D，含TMS內標，VTMS∶VDMSO=3∶10 000）（北京百靈威科技有限公司）；煙堿（標準品，國家煙草質量監督檢驗中心）；煙堿（99.9%，湖北和諾生物工程股份有限公司）；正十七烷（標準品，阿拉丁生化科技股份有限公司）；苯甲酸（99.0%）、檸檬酸（98.0%）、乙酸（99.5%）和三乙胺（99.0%）［梯希愛（上海）化成工業發展有限公司］；純水（自制，電阻率18.2 MΩ·cm）。

Lambda 35紫外-可見分光光度計（美國Perkin Elmer公司）；AVANCE III核磁共振波譜儀（500 MHz，瑞士Bruker公司）；7890A氣相色譜儀（美國Agilent公司）；Excellence T7電位滴定儀（裝配DGi111-SC玻璃pH電極，瑞士Mettler Toledo公司）；ML204電子天平（感量0.000 1 g）（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q純水系統（美國Millipore公司）；NI5CCI-B同軸核磁管（5 mm，美國Norell公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

煙堿溶液：準確稱取1.622 3 g煙堿，用無水乙醇定容至50.0 mL，得到0.2 mol/L煙堿母液；準確移取2.0 mL煙堿母液，用純水定容至50.0 mL，得到8 mmol/L煙堿溶液。

指示劑（BCG或CPR）溶液：準確稱取一定量的指示劑，用純水定容至50.0 mL，得到1 mmol/L指示劑母液；再移取2.0 mL該母液，用純水定容至100.0 mL，得到20μmol/L指示劑測試溶液。

1.2.2 煙堿滴定

移取2.0 mL指示劑（BCG或CPR）測試溶液至若干4 mL離心管中，用10.0μL微量進樣器注射適量8 mmol/L煙堿溶液，得到系列含0～80μmol/L煙堿的混合溶液。將混合溶液搖勻，靜置2 min后進行光譜測試。測試條件：光程10 mm，狹縫寬度1 nm，波長掃描范圍300～700 nm。

1.2.3 Job’s Plot結合比測定

分別配制60μmol/L煙堿溶液和60μmol/L指示劑（BCG或CPR）溶液?？刂瓶倽舛葹?0μmol/L，按照摩爾濃度c煙堿∶c指示劑=0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0混合，將溶液搖勻，靜置2 min后進行光譜測試。測試條件同1.2.2節。

1.2.4 電子煙液游離煙堿的光譜測定

稱取約100 mg電子煙液，用1.0 mL無水乙醇溶解，移取5.0μL該溶液至2.0 mL指示劑測試溶液（20μmol/L）中，將溶液搖勻，靜置2 min后進行光譜測試。測試條件同1.2.2節。

1.2.5 煙液中αfbn的核磁共振法測定

配制煙堿質量分數為20 mg/g的溶液（溶劑：m甘油∶m丙二醇=4∶6）。取適量該溶液，加入等倍于煙堿摩爾數的三乙胺，得到游離煙堿標準溶液；另取適量該溶液，加入5倍于煙堿摩爾數的冰醋酸，得到單質子態煙堿標準溶液。使用同軸核磁管制備樣品，外管中加入適量DMSO-d6作為鎖場溶劑，內管中加入適量電子煙液（或游離煙堿標準溶液、單質子煙堿標準溶液），進行1H NMR測試。

1.2.6 煙液pH的測定

使用pH 4.00鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液、pH 7.00磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液和pH 10.00碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液進行校正。將500 mg電子煙液溶解于5 mL去離子水中，取15 min內3次pH測量結果的平均值。

1.2.7 煙液煙堿總量的測定

稱取約200 mg電子煙液，溶解于50 mL異丙醇（含正十七烷內標），溶液搖勻后直接進行氣相色譜測試。色譜條件：

色譜柱：J&W DB-WAX毛細管柱（30 m×250 μm×0.25μm）；進樣口溫度：250℃；進樣量：2.0μL；分流比：30∶1；載氣：He，流速1.4 mL/min；升溫程序：檢測器：250℃。

使用煙堿的異丙醇標準溶液（含正十七烷內標）繪制標準工作曲線并計算電子煙液煙堿的總量。

2 結果與討論

2.1 溴甲酚綠和氯酚紅的光譜性質

BCG在水溶液中呈現透明的淡綠色，隨煙堿質量分數增加，溶液發生由淡綠色-藍綠色-藍色的轉變，與之對應的光譜（圖3a）中，442 nm處的吸光度逐漸降低，616 nm處的吸光度逐漸升高。CPR在水溶液中呈現透明的淡黃色，隨煙堿質量分數增加，溶液呈現由淡黃色-橙紅色-玫紅色的轉變，與之對應的光譜（圖3b）中，439 nm處的吸光度逐漸降低，587 nm處的吸光度逐漸升高，最大吸收波長逐漸向短波長移動至577 nm。顏色的改變說明BCG和CPR分子與煙堿發生反應，脫質子而呈現離子態的顏色。

圖3 添加不同濃度煙堿的BCG溶液（a，50μmol/L）和CPR溶液（b，50μmol/L）的紫外-可見吸收光譜Fig.3 UV-vis spectra of BCG(a,50μmol/L)solution and CPR(b,50μmol/L)solution in presence of nicotine

固定BCG和煙堿總濃度為60μmol/L，按照不同BCG-煙堿摩爾濃度比例配制溶液，并繪制吸收光譜。取光譜中616 nm（BCG）或587 nm（CPR）的吸光度與摩爾濃度比作圖（Job’s Plot圖，圖4）并考察結合比。結果表明，當c煙堿∶cBCG=1.5～2.3（6∶4～7∶3）時，616 nm處的吸光度最強，可認為BCG與煙堿的結合比為1∶2；同理，當c煙堿∶cCPR=1.5～2.3時，587 nm處的吸光度最強，可認為CPR與煙堿的結合比為1∶2。

向BCG和煙堿的混合溶液中添加0.5倍于BCG摩爾數的苯甲酸或檸檬酸，兩種有機酸均可使溶液顏色改變，且檸檬酸的作用更加明顯（圖5）。CPR呈現與BCG類似的光譜變化，說明由于有機酸的酸性高于兩個指示劑，能夠競爭與煙堿分子中吡咯環N的作用位點，從而使顯色分子回到其分子形態。

圖5 添加或不添加苯甲酸或檸檬酸（10μmol/L）的BCG-煙堿混合溶液（a,20μmol/L+30μmol/L）和CP R-煙堿混合溶液（b,20μmol/L+30μmol/L）的紫外-可見吸收光譜Fig.5 UV-vis spectra of BCG-nicotine(a,20μmol/L+30μmol/L)mixture solution and CPR-nicotine(b,20μmol/L+30 μmol/L)mixture solution in absence and presence of benzoic acid(10μmol/L)or citric acid(10μmol/L)

弱酸性的顯色分子能夠與煙堿反應脫質子變色。但是當有機酸共存于體系中時，由于有機酸較高的親和性，其優先與煙堿反應形成離子對，因此顯色分子只能與未結合的煙堿即游離煙堿反應顯色，從而指示共存體系中游離煙堿的質量分數（圖6）。

圖6 有機酸共存體系中BCG與煙堿的作用機理Fig.6 Proposed interaction mechanism of BCG and nicotine in absence and presence of organic acid

2.2 定量方法的建立

根據以上原理在20μmol/L BCG溶液中添加不同質量分數的煙堿并繪制光譜圖，以616 nm處的吸光度建立了BCG測試FBN的工作曲線：lg A616=0.017 2c-0.537 8，r2=0.998 9（圖7）。其中A616為BCG溶液在616 nm的吸光度，c為電子煙液中FBN的質量分數，單位mg/g。稱量約100 mg電子煙液，用1.0 mL無水乙醇溶解，再移取5μL注射于2.0 mL 20μmol/L的BCG溶液中，混勻后測試光譜。將最低煙堿濃度的溶液重復測試11次，計算其標準偏差，分別以3倍和10倍標準偏差得到方法的檢出限（LOD，0.11 mg/g煙液）和定量限（LOQ，0.37 mg/g煙液），可測量電子煙液FBN的質量分數范圍為0.37～23.36 mg/g。采用相同方法建立了CPR測試FBN的工作曲線：lg A587=0.015 4c-0.813 0，r2=0.993 6，其中A587為CPR溶液在587 nm的吸光度。LOD和LOQ分別為0.19和0.63 mg/g煙液，可測量電子煙液FBN的質量分數范圍為0.63～23.36 mg/g。

圖7 BCG溶液（20μmol/L）和CPR溶液（20μmol/L）用于測試電子煙液FBN質量分數的標準工作曲線Fig.7 Calibration curves for determination of FBN in e-liquids using BCG(20μmol/L)solution and CPR(20μmol/L)solution

2.3 商品化電子煙液的測試

分別測定16個商品化電子煙煙液煙堿總量和煙液pH。運用以上建立的工作曲線，使用BCG和CPR分別測定了電子煙液FBN的質量分數。不同方法所獲得的FBN質量分數及αfbn如表2所示。煙液煙堿＜20 mg/g時，pH法測得的αfbn平均值為65.8%，光譜法測得的αfbn平均值為76.1%；煙液煙堿＞20 mg/g時，pH法測得的αfbn平均值為10.7%，光譜法測得的αfbn平均值為19.2%。這說明電子煙液廠商在提供較高煙堿攝入量時采用了低游離煙堿的策略以降低生理沖擊感。

表2 16個商品化電子煙液游離煙堿（FBN）質量分數和游離煙堿質量百分比（αfbn）Tab.2 Mass fractions of free-base nicotine（FBN）and proportions of FBN(αfbn)in 16 commercial e-liquid samples

總體而言，pH方法測試的結果與光譜方法存在一定的偏離，特別是游離態煙堿比例較低時，pH換算所得αfbn明顯低于光譜方法（表2和圖8），可能是由于pH測試前用水稀釋煙液。煙液溶劑多為甘油和丙二醇，用電極進行pH測試時溶劑組成的不確定容易帶來測試結果的誤差［19］。采用本研究中所建立的光譜方法測試時，將電子煙液濃度稀釋為原來的1/4 000，可保證溶劑體系的一致性。由圖8還可知，使用BCG所獲得的αfbn值高于CPR，可能是由于BCG（p Ka=4.24）的吸電子能力高于CPR（p Ka=6.11），BCG與有機酸的競爭能力更強，因此在低αfbn時BCG所能結合的煙堿多于CPR。

圖8 不同測試方法所獲得的電子煙液游離煙堿質量百分比（αfbn）Fig.8 Proportions of free-base nicotine(αfbn)in e-liquid samples obtained by p H method and by spectroscopic methods

2.4 測試結果的驗證

按照Duell等［14］的方法，將煙堿-三乙胺（1∶1，摩爾比）溶于甘油-丙二醇（m甘油∶m丙二醇=4∶6）中制得游離煙堿標準煙液，將煙堿-冰醋酸（1∶5，摩爾比）溶于甘油-丙二醇（m甘油∶m丙二醇=4∶6）中制得單質子態煙堿標準煙液。利用1H NMR譜圖，通過煙堿吡啶環Ha～Hd的化學位移δHa～δHd和吡咯環甲基He的化學位移δHe［21］，換算得到電子煙液的αfbn，如表3所示。光譜法測得6個電子煙液的αfbn與1H NMR方法具有較好的相關性（圖9），其中使用CPR的測定值與1H NMR法的R2=0.985 5，優于使用BCG的測定值（R2=0.961 4）。由于1H NMR測定過程不涉及煙液樣品的前處理，保留了煙堿在電子煙液中的形態分布信息，因此使用CPR進行αfbn的光譜測定，可更真實地反映電子煙液中煙堿的游離狀態。

表3 標準煙液和商品化電子煙液中煙堿化學位移（δ）和游離煙堿質量百分比（αfbn）①Tab.3 Chemical shifts(δ)and proportions of free-base nicotine(αfbn)in standard and commercial e-liquid samples

圖9 光譜方法和NMR方法測定的游離煙堿質量百分比（αfbn）比較Fig.9 Proportions of free-base nicotine(αfbn)determined by UV-vis method and by 1H NMR method

3 結論

①指示分子溴甲酚綠（BCG）和氯酚紅（CPR）與游離煙堿發生顯色反應，不與質子態煙堿反應，因此能夠建立光譜信號與游離煙堿的定量關系。②16個商品化電子煙液煙堿大于20 mg/g時，αfbn平均值為19.2%；煙液煙堿小于20 mg/g時，αfbn平均值為76.1%。③煙液中游離煙堿質量百分比（αfbn）較低時，光譜方法測定結果與pH方法存在較大差異，且BCG測得的αfbn高于CPR。④用1H NMR法對測定結果進行驗證，CPR的測定結果與1H NMR法具有較好的相關性，可更真實地反映電子煙液中煙堿的游離狀態。