新疆某地區3個牧場布魯氏菌病流行狀況調查及分析

楊 琴，鄧肖玉，張 歡，易繼海，王 勇，張 倩，王 震，陳創夫*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000；2.人獸共患傳染性疾病防治協同創新中心,新疆石河子 832000；3.新疆農墾科學院省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，新疆石河子 832000；4.動物疫病防控兵團重點實驗室，新疆石河子 832000)

新疆是我國重要的畜牧基地，也是養殖反芻動物的重要省份。2017年，新疆的牛肉產量(43萬噸)及羊肉產量(58萬噸)分別占全國牛肉及羊肉總產量的6.8%和12.4%[1-2]。新疆肉牛、羊養殖業的主要產區往往在南疆、北疆部分偏遠地區,畜牧業作為當地的支柱性產業,是農牧民收入的主要來源[3-4]。布魯氏菌病(簡稱“布病”)是一種由布魯氏菌感染引起的人獸共患傳染病，家畜感染后常表現為流產及繁殖障礙，嚴重影響生產性能，對人類健康及畜牧經濟造成極大危害[5-6]。新疆一直是傳統的布病流行區[7-8]。自20世紀80年代，有效的防控策略已使布病疫情得到基本控制，但進入21世紀后，布病再次卷土重來[9]，新疆布病疫情也出現抬頭趨勢[10-11]，2013年，養殖人員及畜產品銷售加工人員的布病感染率明顯上升[12]，而帶菌動物是人類布病的主要傳染源，人往往通過直接接觸感染動物或食用未加工消毒的牛奶及奶制品而感染。人間布病疫情形勢嚴峻。病原學監測顯示，羊種布魯氏菌是誘發人患布病的主要菌種[13]。

為了解新疆某地牛、羊感染布病的情況，為布病的預防、控制及凈化提供科學依據，本研究通過布病血清學診斷(虎紅平板凝集試驗)、分子生物學檢測及分子流行病學分析，2017年-2018年對新疆某偏遠地區的牛、羊開展布魯氏菌流行病學調查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及保存 2017年-2018年的春季，在新疆某偏遠地區選擇3個操作便利，且對當地牛、羊養殖具有代表性的牧場，采用簡單隨機抽樣的方法對3個牧場的牛、羊進行頸靜脈采血，采集對象為飼養2周齡以上且未經布魯氏菌疫苗接種的牛、羊。共采集有效血液樣本2 996份，其中牧場A采集血液樣本為牛354份，羊351份；牧場B牛342份，羊361份；牧場C牛710份，羊878份，所有血樣置4℃短暫保存，分離血清后置-20℃保存；收集疑似病例的流產胎兒樣本141份，其中包括牛流產胎兒66份、羊流產胎兒75份，置-20℃保存；另收集生鮮乳樣本85份，其中包括牛生鮮乳65份及羊生鮮乳23份，置4℃保存。

1.1.2 主要試劑 基因組提取試劑盒、TaqPCR聚合酶，北京天根生化科技有限公司產品；DNA Marker，TaKaRa公司產品；布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原及布魯氏菌標準陰、陽性血清由中國獸醫藥品監察所提供。

1.1.3 主要儀器設備 可調移液器，德國艾本德有限公司產品；DYY 6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；高速冷凍離心機、PCR儀，美國賽默飛世爾科技有限公司產品；瓊脂糖凝膠成像儀，美國伯樂生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 布魯氏菌PCR鑒定引物[14]由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物

1.2.2 血清的制備、病料的處理及DNA提取 采集的血液樣本置于室溫環境下(18℃～25℃)靜置4 h，使用5 000 r/min離心5 min后分離血清，保存于-20℃備檢；按照試劑盒說明書提取流產胎兒的肝臟、脾臟(均各取一小片組織約0.5 g并充分研磨)及生鮮乳樣本的DNA，樣品置-20℃保存。

1.2.3 布魯氏菌病血清學檢測 在玻璃板上標記好待檢血清號，分別加入30 μL相應血清和30 μL抗原，混勻后平鋪約2 cm，3 min后肉眼觀察凝集情況，同時設定陰、陽性對照。判定標準如下：出現肉眼可見凝集現象則初步判定為布魯氏菌陽性，無凝集現象判定為陰性。

1.2.4 布魯氏菌的PCR篩查 以上述提取的全基因組DNA為模板，用布魯氏菌鑒定引物omp22進行PCR擴增。PCR反應體系(10 μL)：TaqPCR聚合酶5 μL，上、下游引物各0.2 μL，高壓滅菌水3.6 μL，模板1 μL。PCR反應條件：95℃ 5 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 40 s，72℃ 40 s，循環數35；72℃ 10 min。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，篩選布魯氏菌陽性樣本。

1.2.5 布魯氏菌的種屬鑒定 以上述陽性樣本的DNA為模板，用布魯氏菌鑒定引物IS711進行PCR擴增，PCR反應體系(40 μL)：TaqPCR 聚合酶20 μL，上、下游引物各0.8 μL，高壓滅菌水14.4 μL，模板4 μL。PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 2 min，55℃ 2 min，延伸72℃ 2 min，循環數30；72℃ 10 min。取10 μL PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.6 系統進化樹分析 取上述IS711擴增的PCR產物約30 μL置于無菌EP管中，封口膜封閉后送上海生工生物工程技術服務有限公司進行純化和測序。使用分子進化遺傳分析軟件(MEGA)對引物IS711擴增出的基因序列進行分析。

2 結果

2.1 布魯氏菌病的血清學檢測

結果見表2。從新疆某地牧場A、牧場B和牧場C共采集了2 996份血清樣本，其中包括牛血清樣本1 406份及羊血清樣本1 590份，通過RBPT初步篩選。結果顯示，3個牧場RBPT平均陽性率為牛6.8%，羊9.5%，其中牧場A陽性率為牛7.1%，羊9.1%；牧場B陽性率為牛11.7%，羊10.8%；牧場C陽性率為牛4.2%，羊9.1%。

表2 虎紅平板凝集檢測結果

2.2 布魯氏菌的PCR篩查

結果見表3。將牛流產胎兒66份、羊流產胎兒75份、牛生鮮乳42份及羊生鮮乳23份經DNA提取后以布魯氏菌omp22為引物進行PCR擴增，結果顯示，共檢測出布魯氏菌PCR陽性樣本54份，其中包括牛流產胎兒22份、羊流產胎兒30份、牛生鮮乳1份以及羊生鮮乳1份。流產胎兒布魯氏菌PCR檢出率為牛33.3%，羊40%；生鮮乳檢出率為牛2.4%，羊4.3%。

表3 布魯氏菌的PCR鑒定結果

2.3 布魯氏菌的種屬鑒定

結果見圖1(僅展示部分結果)。用IS711引物對上述PCR陽性樣本進行進一步的PCR擴增，共檢測出38份陽性樣本，其中包括牛流產胎兒16份、羊流產胎兒20份、牛生鮮乳1份及羊生鮮乳1份。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,1～13和15～17均擴增出731 bp的條帶，與羊種布魯氏菌陽性對照條帶大小一致，鑒定為羊種布魯氏菌。

M.DNA標準DL 1 000；1～17.PCR擴增產物；18.羊種布魯氏菌陽性對照；19.牛種布魯氏菌陽性對照；20.陰性對照

2.4 系統進化樹分析

結果見圖2。取上述PCR產物進行純化和測序，基于測序后的IS711基因序列構建系統進化樹，已完成測序的IS711序列已存入GeneBank數據庫(IS711：MK913893-MK913898)。進化樹分析結果顯示，本研究所鑒定出的羊種布魯氏菌與內蒙古地區、挪威及印度等國分離出的羊種布魯氏菌生物3型菌株關系最為密切。

圖2 布魯氏菌IS711基因序列的系統進化樹

3 討論

畜牧業是新疆歷史悠久的傳統產業,也是當地農村經濟的重要組成部分，尤其在新疆部分偏遠地區，畜牧養殖往往是其經濟增長的主要來源。然而，關于這些地區布病的流行病學調查及病原學研究較少。研究表明，2014年新疆伊犁地區的牛、羊布病陽性率分別為1.72%和1.95%[15]。據伊犁市動物疾病與預防控制中心提供的數據顯示，2015年該地區的牛、羊布病陽性率分別為6.91%和4.21%，同樣也有調查顯示，2015年新疆阿勒泰地區的牛、羊布病陽性率分別為4.09%和3.45%[5]。由此可見，雖然國家已制定了畜群疫苗接種的布病防治規劃，且將新疆劃為重點布病防控區，但新疆部分地區畜群間布病疫情仍呈現上升趨勢。本研究調查了新疆某偏遠地區3個牧場牛、羊布病感染情況，采用RBPT對2 996份牛、羊血清進行初步篩選。結果表明，該地區3個牧場RBPT平均陽性率為牛6.8%，羊9.5%，其中牧場A陽性率為牛7.1%,羊9.1%；牧場B陽性率為牛11.7%,羊10.8%；牧場C陽性率為牛4.2%,羊9.1%。這些數據表明，布病極大可能已在該地區廣泛流行，并可能已經感染了該地區的所有易感牲畜，應引起相關部門的高度重視。此外，本次篩查結果顯示，牧場B的RBPT陽性率最高達到11.7%，牧場C最低陽性率為4.2%，出現這種現象的原因可能是由于本次試驗的采樣點不均勻，且3個牧場的檢疫和淘汰力度不同，造成陽性率出現較大差異。

布病的主要傳染源是患病及帶菌家畜，患病的妊娠母畜是尤其危險，在流產或分娩的一系列過程中，胎兒、胎衣及羊水的排出常常摻雜著大量的布魯氏菌[16]，造成草場、畜舍等周邊環境的污染，易感動物和人接觸到以上污染物，就可通過消化道、呼吸道、生殖道以及損傷的皮膚、黏膜而感染[17]。PCR是常用的布病診斷方法[18-19]。本研究通過PCR檢測從牛、羊流產胎兒中篩選出大量布病陽性樣本，一方面提示布魯氏菌感染是造成該地區牛、羊流產的一個重要因素，帶菌的妊娠母畜及其流產胎兒是污染源和傳染源；另一方面也提示養殖人員在進行家畜的接產時要格外注意做好自身防護，以防感染。除帶病家畜的分泌物、排泄物及流產胎兒中含有大量的布魯氏菌外，其生鮮乳中同樣帶有相當數量的布魯氏菌，是極其危險的傳染源之一[20]。陜西發生多起因飲用未經消毒的生鮮羊乳而發生布病感染的事件[21]，更進一步說明生鮮乳作為布病的重要傳染源，給人類的健康帶來了嚴重隱患。本研究在牛生鮮乳及羊生鮮乳中均鑒定出了羊種布魯氏菌，表明牛、羊感染羊種布魯氏菌已成為我國一個重大的公共衛生問題?；疾〉呐?、羊作為傳染源，可通過其污染性生鮮乳的流通傳播疾病，嚴重威脅畜牧業的發展和人類健康。因此，當地相關部門應加強對生鮮乳及各類動物產品的布病檢疫，堅決杜絕檢疫不合格的產品流向市場。

不同種的布魯氏菌有其一定的寄生宿主，比如羊種菌多寄生在羊只，牛種菌多寄生于牛。但也常發現有宿主轉移現象，即羊種菌可能轉移到牛、豬，或相反[22-23]。有研究表明，新疆伊犁某地牛流產胎兒中可分離出羊種布魯氏菌[24]。本研究通過PCR檢測從16份牛流產胎兒、20份羊流產胎兒、1份牛生鮮乳以及1份羊生鮮乳樣本中共鑒定出38份羊種布魯氏菌。有趣的是，16份牛流產胎兒樣本中均擴增出了羊種布魯氏菌，而這16份牛流產胎兒樣本中有10份取自牛、羊混養牧場，表明混合飼養的養殖方式可能造成了布魯氏菌寄生宿主的轉移，提示當地牧民應適當改變傳統飼養方式，加強對科學飼養管理模式的學習。此外，本研究基于PCR陽性樣本基因序列構建系統進化樹進行分析，發現羊種布魯氏菌是該地區牛、羊感染布病的優勢菌種，且與內蒙古地區、印度和挪威等國分離的羊種布魯氏菌生物3型序列相似度極高，這一方面說明羊種布魯氏菌的致病力和侵襲力很強，可能成為世界范圍內的流行菌種；另一方面也提示，若需引進種畜或補充畜群時，要避免來自這些國家或地區的家畜?？傊?，本研究通過調查新疆某偏遠地區的牛、羊布病流行情況，發現該地區畜間布病疫情形式嚴峻，羊種布魯氏菌是引起該地區牛、羊布病的主要菌種。因此，加強該地區的布病監測及檢疫力度，高效實施特定疫苗接種計劃，鼓勵當地農牧民學習并采用科學的管理制度是當務之急。