Rab18通過PPARγ下調PLIN2以減少巨噬細胞脂質蓄積*

張 榮， 李曉歌▲， 陳雁斌， 蔣思怦， 楊 麗， 袁中華△

（1南華大學心血管疾病研究所，動脈硬化學湖南省重點實驗室，湖南省動脈硬化性疾病國際科技創新合作基地，湖南衡陽421001；2湘南學院附屬醫院，湖南郴州423000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以脂質代謝紊亂和炎癥為主要病理基礎的疾病，其發病機制尚未闡明［1］。動脈粥樣硬化的主要細胞學改變是泡沫細胞的形成，泡沫細胞是由巨噬細胞或血管壁平滑肌細胞攝入大量脂質轉化而來。大量攝入的脂質以脂滴（lipid droplets，LDs）的形式貯存在細胞內［2］。減少脂滴數量，抑制脂質蓄積有助于防治動脈粥樣硬化。小GTP結合蛋白Rab18是位于脂滴表面的脂滴包被蛋白［3］，參與調節脂質代謝和脂滴形成［4］。此外，有研究表明過表達Rab18時細胞內脂質蓄積減少，能減緩動脈粥樣硬化的發生，但尚未闡明其具體機制［5-6］。

脂肪分化相關蛋白——脂滴包被蛋白2（perilip?in 2，PLIN2）是PAT家族中的一員，包裹在脂滴周圍［7］。參與脂滴形成和脂質蓄積［8-9］。本課題組前期研究發現沉默表達PLIN2后，細胞內脂質蓄積減少，過表達PLIN2時脂質蓄積增加［10］。過表達高活型Rab18明顯降低PLIN2表達，減少脂質蓄積［11］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptorγ，PPARγ）是核受體超家族PPARs中的重要成員，主要分布在脂肪組織及巨噬細胞中，是脂質合成的重要調節因子［12］。在PPARγ?/?小鼠中，脂質蓄積明顯減少。PPARγ過表達可上調PLIN2表達，且促進細胞內脂質蓄積［13-14］。

Li等［15］發現，Rab21可通過PPARγ影響脂質蓄積。Rab18與Rab21均為Rab家族成員，推測Rab18或許也可通過PPARγ來影響脂質蓄積。此外，本課題組前期實驗已證實PLIN2升高可促進巨噬細胞內脂質蓄積［16］。因此，本研究在此基礎上進一步探討Rab18是否通過影響PPARγ表達而調控PLIN2水平，進而影響巨噬細胞內脂質蓄積。

材料和方法

1 主要試劑

THP-1細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。RPMI-1640培養液（HyClone）；胎牛血清（杭州四季青公司）；氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）購自奕源生物科技公司；Lipo-6000TM轉染試劑（上海碧云天生物科技公司）；表達高活型（high-ac?tivity，HA）Rab18［Rab18（Q67L）］、野生型（wildtype，WT）Rab18［Rab18（WT）］和低活型（low-activi?ty，LA）Rab18［Rab18（S22N）］的慢病毒載體質粒及DH5α甘油菌購自佳和生物科技有限公司；PPARγ激動劑GW1929和抑制劑T0070907購自MCE；抗PLIN2、PPARγ、Rab18和GAPDH抗體及山羊抗兔/抗鼠IgGⅡ抗均購自Proteintech；其它試劑均為進口或國產分析純。

2 主要方法

2.1 細胞培養 在5%CO2、37℃的培養箱中培養THP-1巨噬細胞，視細胞生長狀態換液，細胞貼壁率約75%時傳代。

2.2 質粒擴增與檢測 根據Ozeki等［17］的報道，我們在巨噬細胞中，分別用Rab18（WT）、Rab18（Q67L）和Rab18（S22N）質粒制備表達WT、HA和LA Rab18的細胞。將含Rab18（WT）、Rab18（Q67L）和Rab18（S22N）質粒的菌液解凍混勻，用接種環蘸取菌液劃板，倒置放于37℃細菌培養箱中培養12~16 h。將不同活性的Rab18大腸桿菌視菌落生長情況，分別加入含有3 mL氨芐西林液體的培養液中，37℃搖床上擴增12 h（220 r/min）。分別取1 mL擴增后的培養液轉移至100 mL液體培養液中，37℃搖床上（220 r/min）繼續擴增大腸桿菌，12 h后收菌。將各菌液分別用無內毒素大提質粒盒提取Rab18（WT）和Rab18（Q67L）、Rab18（S22N）質粒，用紫外分光光度法測量A260/A280比值，檢測提取各質粒的濃度及純度。

2.3 細胞轉染 將THP-1巨噬細胞在轉染前一天接種到不含抗生素的6孔板中，待細胞密度達到75%左右后進行轉染。分別用250μL DMEM培養液稀釋5μg Rab18（WT）、Rab18（Q67L）和Rab18（S22N）質粒靜置5 min，取10μL Lipo-6000TM轉染試劑用移液槍加入250μL DMEM培養液中靜置5 min。然后將上述試劑分別混勻靜置20 min后分別加入6孔板中，并置于37℃細胞培養箱中培養4~6 h。然后將6孔板中的培養基更換為只含血清的培養基，繼續培養1~2 d后用Western blot或熒光顯微鏡檢測轉染效果。

2.4 油紅O染色 將THP-1細胞種于6孔板中，用50 mg/L ox-LDL孵育0、6、12和24 h，然后使用50 mg/L ox-LDL孵育24 h；PBS沖洗細胞（3次，每次10 min），在室溫下用4%甲醛溶液固定30 min，再次用PBS沖洗細胞（3次，每次10 min）后與新鮮的過濾油紅色O溶液一起孵育30 min；最后用蘇木素復染，在光學顯微鏡下記錄細胞的圖像并根據油紅O染色后的細胞內脂滴的面積進行半定量分析。

2.5 細胞免疫熒光染色 室溫下，用?20℃保存的100%乙醇固定細胞，10 min后用PBS清洗。室溫下，將固定好的細胞加入0.2%Triton X-100，5 min后用PBS清洗3 min×3次。然后，加入用PBS稀釋的5%的血清，室溫下封閉1 h。吸出封閉液，并加入稀釋好的Ⅰ抗，室溫下孵育1.5 h后用PBS清洗3 min×3次。加入棕色EP管中稀釋好的熒光Ⅱ抗，室溫、避光、潮濕條件下孵育1 h后，用PBS清洗3 min×3次。然后用DAPI染細胞核，10 min后避光拍照，存檔。

2.6 Western blot分析 將待提取的未處理THP-1細胞或經轉染后的THP-1細胞中加入細胞裂解液置冰上裂解，提取總蛋白。使用BCA法對蛋白定量。制備10%SDS-PAGE分離蛋白，蛋白經SDS-PAGE凝膠分離后轉移至聚偏二氟乙烯膜上；轉膜結束后經脫脂牛奶4℃搖床封閉4 h，后分別加入相應Ⅰ抗，4℃搖床上搖動孵育過夜；用TBST以10 min每次清洗3次；接著加入對應的Ⅱ抗，4℃搖床震蕩孵育2 h，TBST洗膜，使用ECL法進行顯影。

3 統計學處理

使用GraphPad Prism 8.0、SPSS和Image-Pro Plus軟件統計分析結果，并作圖。重復上述實驗3次以上，實驗結果用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間均數比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 ox-LDL處理THP-1巨噬細胞不同時間后對Rab18、PPARγ和PLIN2表達及細胞內脂質蓄積的影響

用50 mg/L ox-LDL孵育THP-1巨噬細胞0、6、12和24 h。Western blot檢測結果顯示，在巨噬細胞中Rab18、PPARγ及PLIN2的蛋白表達水平在24 h內隨ox-LDL處理時間的延長而增加（P<0.05），見圖1。

油紅O染色后脂質半定量分析結果顯示，巨噬細胞中脂質蓄積隨著ox-LDL孵育時間的延長而不斷增多（P<0.05），見圖2。

2 不同活性Rab18對荷脂巨噬細胞內PPARγ和PLIN2表達及脂質蓄積的影響

不同活性Rab18質粒轉染細胞的免疫熒光染色圖見圖3。

Western blot檢測結果顯示，50 mg/L ox-LDL孵育各組細胞24 h后，WT組、HA組和LA組中Rab18表達較control組明顯升高，但各轉染組間Rab18表達的差異無統計學顯著性，見圖4A；與control組相比，WT組和HA組細胞中PPARγ和PLIN2的表達量均顯著下降（P<0.05），LA組細胞中PPARγ和PLIN2表達無明顯變化，見圖4B。

油紅O染色結果顯示，與control相比，WT組與HA組細胞內脂質蓄積均明顯減少（P<0.05），而LA組細胞內脂質蓄積無明顯變化，見圖5。

3 Rab18對荷脂巨噬細胞內PPARγ核轉位的影響

首先我們用免疫熒光法觀察荷脂巨噬細胞中Rab18與PPARγ的共定位情況，發現Rab18（紅色熒光）與PPARγ（綠色熒光）在荷脂巨噬細胞中確實存在免疫熒光共定位（圖6A）。然后，我們將細胞分為control組和HA組，用50 mg/L ox-LDL孵育24 h后，免疫熒光觀察PPARγ核轉位情況，結果顯示，與control組相比，HA組細胞核內綠色熒光明顯減弱（圖6B）。

4 PPARγ激動劑GW1929和抑制劑T0070907對表達HA Rab18的荷脂巨噬細胞中PLIN2表達及脂質蓄積的影響

將細胞分為4組：control組、HA組、HA+GW1929（600 nmol/L孵育24 h）組和HA+T0070907（100 nmol/L孵育24 h）組，各組分別加入ox-LDL共孵育24 h。

Western blot檢測結果顯示，在荷脂巨噬細胞中，與control組相比，HA組PLIN2表達顯著降低（P<0.05）；HA組加入PPARγ激動劑GW1929后，PLIN2表達明顯增多（P<0.05）；與HA組比，HA+T0070907組PLIN2表達進一步降低（P<0.05），見圖7。

Figure 2.Lipid accumulation was increased in THP-1 macrophages with the extension of ox-LDL incubation time（oil red O staining，sclae bar=20μm）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs0 h group.圖2 隨著ox-LDL孵育時間的延長巨噬細胞中脂質蓄積增加

免疫熒光染色結果顯示，與control組相比，HA組中PLIN2熒光強度明顯減弱；與HA組相比，HA+GW1929組細胞中PLIN2熒光強度明顯增強；另外，HA+T0070907組細胞中PLIN2熒光強度較HA組進一步減弱（P<0.05），見圖8。

油紅O染色結果顯示，與對照組相比，HA細胞組脂質蓄積減少，加入PPARγ抑制劑后脂質蓄積進一步減少；與HA組相比，加入PPARγ激動劑組細胞內脂質蓄積明顯增加（P<0.05），見圖9。

討 論

AS性心腦血管疾病嚴重損害人體健康，是當前病死率較高的一類疾?。?8］，其發病機制尚不明確，脂質代謝異常是公認的主要發病因素之一［19-20］。Rab18與以AS為病理基礎的心血管疾病密切相關［21］。Rab18存在于真核細胞幾乎全部的細胞器膜上，有活化和失活兩種形式［22］。Rab18中的G結構域與GTP結合時Rab18活化并可以被募集在細胞器膜如脂滴膜上，進而與其效應蛋白相互作用，發揮膜運輸、囊泡轉運和信號轉導等作用［17］；當GTP轉換為GDP時，Rab18失活并失去生物學功能［23］。脂滴分解時高活型Rab18分布在脂滴的表面加速基礎脂肪的分解進而減少脂質蓄積［24］，這提示Rab18可通過減少泡沫細胞形成進而抑制AS發生發展，但Rab18減少脂質蓄積的具體機制尚不明了。本研究則表明，Rab18是通過PPARγ調控PLIN2的表達從而抑制了巨噬細胞內脂質蓄積。

Figure 3.Immunofluorescence experiments showed wild-type（WT），high-activity（HA）and low-activity（LA）Rab18 plasmid trans?fection situation.Rab18 visualized by FITC-conjugated AffiniPure（green）.The scale bar=20μm.圖3 野生型、高活型和低活型Rab18質粒的轉染情況

Figure 4.The changes of the expression of Rab18（A），PLIN2 and PPARγ（B）in the cells expressing wild-type（WT），high-activity（HA）and low-activity（LA）Rab18.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.圖4 各轉染組細胞中Rab18、PPARγ和PLIN2表達的變化

既往研究表明，PLIN2是脂滴膜上的重要圍脂滴蛋白［25］。PLIN2 N端的PAT結構域維持脂滴的穩定；其親脂性C端，促進脂質合成［9，25］。此外PLIN2能通過調節脂滴周圍脂肪合成與分解相關的酶，促進脂滴中脂質核心膽固醇酯和甘油三酯的合成，進而增加細胞內脂質蓄積［8，26］。細胞受脂肪分解刺激時，泛素-蛋白酶體溶解PLIN2的N端，脂滴的動態平衡被破壞，細胞脂質蓄積減少［25，27］。Makino等［28］研究顯示，Rab18與PLIN2均參與調節以AS為病理基礎的心血管疾病，且過表達高活型Rab18時PLIN2下調，但兩者之間的具體機制尚不清楚。細胞核轉錄因子PPARγ是巨噬細胞內脂質代謝的重要調節因子［29］，其C端有配體結合區域，與配體結合后被激活，然后其N端的DNA結合結構域與視黃醇類X受體（reti?noicacid retinoid X receptor，RXR）結合形成異二聚體，進而與下游基因啟動區域中的DNA序列即過氧化物酶體增殖物反應元件（peroxisome proliferator re?sponse element，PPRE）序列相結合，從而調節目的基因的轉錄。PLIN2是PPARγ的靶基因之一，PPARγ可與PLIN2啟動子上的PPRE序列相結合，促進PLIN2的表達及LDs形成［30］。Rab21可通過PPARγ/肝X受體（liver X receptors，LXR）信號通路，促進脂質蓄積。Rab18與Rab21均為Rab家族中成員。由此我們猜想Rab18是否也可通過PPARγ調節脂質蓄積。PPARγ 過表達時PLIN2的表達升高［29］，提示Rab18與PPARγ和PLIN2之間可能存在相互作用，但其具體機制尚不明確。

Figure 5.Changes in intracellular lipid accumulation in each transfection group（oil red O staining，sclae bar=20μm）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.圖5 各轉染組細胞內脂質蓄積變化情況

Figure 6.Co-localization of Rab18（red）and PPARγ（green）in lipid-laden macrophages（A），and the effect of Rab18 on PPARγ（green）protein and its nuclear（blue）translocation in lipid-laden macrophages（B）.The scale bar=20μm.圖6 荷脂巨噬細胞中Rab18與PPARγ共定位情況及Rab18對PPARγ蛋白及其核轉位的影響

Figure 7.Effects of GW1929 and T0070907 on the expression of PLIN2 in the lipid-laden macrophages expressing high-activity（HA）Rab18 were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs HA group.圖7 Western blot檢測GW1929和T0070907對表達高活型Rab18的荷脂巨噬細胞中PLIN2表達的影響

Figure 8.Effects of GW1929 and T0070907 on the expression of PLIN2 in the lipid-laden macrophages expressing high-activity（HA）Rab18 were detected by immunofluorescence staining（scale bar=20μm）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs HA group.圖8 免疫熒光染色檢測GW1929和T0070907對表達高活型Rab18的荷脂巨噬細胞中PLIN2表達的影響

我們的研究結果顯示Rab18各活性轉染組間Rab18表達水平的差異無統計學顯著性，但表達野生型Rab18和高活型Rab18的細胞中PPARγ和PLIN2表達量均顯著下降，脂質蓄積減少；表達低活型Rab18的細胞中PPARγ和PLIN2表達及脂質蓄積均無明顯變化。不同活性Rab18在巨噬細胞中表達無差異但對PPARγ和PLIN2表達及脂質蓄積影響不同，是因為實驗中不同活性Rab18發揮生物學作用的差異與其蛋白表達量無關，而與其自身生物學功能有關［31］。這進一步說明Rab18與PPARγ可能存在相互作用。同時，我們觀察到Rab18與PPARγ存在共定位，表達高活型Rab18的細胞中轉入細胞核內的PPARγ明顯減少，且細胞內PPARγ含量明顯降低。以上實驗結果說明，Rab18能下調PPARγ表達，且抑制PPARγ轉入細胞核內。轉入細胞核的PPARγ減少，是否會影響其下游基因PLIN2表達尚待進一步研究。Kim等［13］發現PPARγ激動時PLIN2表達明顯上調。本實驗發現，表達高活型Rab18的細胞中PPARγ激動時，PLIN2表達與對照組相比差異無統計學顯著性。這說明活化的Rab18能抑制PPARγ激動時對PLIN2表達的促進作用。另外，我們的檢測結果顯示表達高活型Rab18的細胞中PPARγ被抑制時，Rab18抑制PLIN2的作用進一步增強，說明Rab18可通過PPARγ影響PLIN2的表達，從而調控巨噬細胞脂質蓄積。

Figure 9.Effects of GW1929 and T0070907 on lipid accumulation in the lipid-laden macrophages expressing high-activity（HA）Rab18（oil red Ostaining，sclae bar=20μm）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs HA group.圖9 GW1929和T0070907對過表達Rab18的荷脂巨噬細胞脂質蓄積的影響

綜上所述，我們的實驗表明，Rab18可減少巨噬細胞脂質蓄積，其發生機制是通過PPARγ下調PLIN2的表達，從而減少細胞脂質蓄積。這一機制的發現可能為AS的防治提供新的實驗依據。