PBMC中CARD9、MDC、IL-32在潰瘍性結腸炎診斷和病情評估中價值

謝玥 張紹衡 熊瑤 于長輝

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是消化內科常見疾病類型，以腹瀉、腹痛、黏液膿血便為主要特征，具有反復發作、遷延難愈特點，因此準確地對UC 做出診斷及評估病情意義重大［1］。目前結腸鏡檢查和造影是診斷UC 有效方法，但為侵入性，部分患者接受度較差，且不能用于肛管直腸狹窄、腸穿孔、急性期感染、肛周膿腫及嚴重心腦血管病變者等，具有一定局限性。胱天蛋白酶募集域蛋白9（Caspase recruitment domain -containingprotein 9，

CARD9）基因多態性可增加炎癥性腸病易感性，敲除CARD9基因后，腸道炎性反應損傷明顯改善［2］。髓樣樹突狀細胞（Myeloid dendritic cell，MDC）在免疫反應和免疫耐受中起到重要作用，可影響腸道黏膜免疫功能及腸道通透性，而UC 患者腸壁內存在過度免疫激活及腸黏膜屏障功能的改變，故推測MDC 與UC 有關［3-4］。白介素-32（Interleukin-32，IL-32）主要由淋巴細胞、自然殺傷細胞等產生，是一種炎癥細胞因子，與病毒感染、乙肝等多種炎癥類疾病的發生有關［5-6］。本研究探討PBMC 中CARD9、MDC、IL-32 在潰瘍性結腸炎診斷和病情評估中價值，旨在為臨床診療提供參考，報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年1月南方醫科大學珠江醫院消化內科收治的82 例潰瘍性結腸炎患者（UC 組）及體檢中心40 例健康體檢人群（對照組）進行前瞻性研究，其中UC 組女46 例，男36 例，年齡平均（35.49±4.68）歲，體質量指數平均（22.37±1.21）kg/m2；對照組女18 例，男22 例，年齡平均（36.22±4.07）歲，體質量指數平均（22.48±1.05）kg/m2。兩組性別、年齡等資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經本院倫理委員會審核通過，患者及家屬均知情同意。

納入標準：①符合UC 診斷標準［7］；②首次確診，既往無相關治療史；③年齡＞18 歲；④自愿簽署知情同意書。排除標準：①血液系統疾病者；②自身免疫疾病者；③合并惡性腫瘤者；④妊娠期患者。

1.2 方法

1.2.1 UC 病情程度評估［7］

參考改良Mayo 評分評估病情，緩解期：＜3 分，活動期：≥3 分；輕度：3～5 分；中度：6～10 分；重度：11～12 分。

1.2.2 檢測方法

采集清晨空腹肘部靜脈血5 mL，應用Ficoll 密度梯度離心法分離純化外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），應用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測PBMC 中CARD9mRNA、IL-32mRNA，其中CARD9mRNA 上游引物5′-CCGCGTCTTCTCCATGAT-3′，下游引物5′-CCGCAGCTCCTTGATGAA-3′，IL-32mRNA 上游引物5′-CGACTTCAAAGAGGGCTACC-3′，下游引物5′-GAGTGAGCTCTGGGTGCTG-3′，內參β-actin 上游引物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物5′-CTACGGAGCAATGATCTTGA-3′，收集每個反應管內熒光信號達到設定的閾值四所經歷的循環數（Cycle threshold，Ct）值后應用ΔΔCt 法檢測基因的相對表達量，ΔCt 實驗組基因=實驗組基因的Ct 值-實驗組的β-actin Ct 值，ΔCt 對照組基因=對照基因的Ct 值-對照組β-actin 的Ct 值，ΔΔCt=ΔCt 實驗組基因-ΔCt 對照組基因，檢測基因相對表達量=2-ΔΔCt；應用流式細胞儀（深圳邁瑞公司BricyteE6）檢測MDC 水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 處理數據，計量資料以（）表示，多組間比較以單因素方差分析，兩兩比較以LSD-t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗，采用受試者工作特征曲線（ROC）及ROC 下面積（AUC）分析各指標診斷UC 價值，采用Spearman 及多分類Logistic 回歸方程分析各指標與UC 活動期患者病情程度關系。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組各檢測指標比較

UC 組CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 及CARD9 蛋白、IL-32 蛋白高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組各檢測指標比較（±s）Table 1 Comparison of test indicators between 2 groups（±s）

組別UC 組對照組t 值P 值例數82 40 CARD9 mRNA 0.85±0.27 0.46±0.15 8.506＜0.001 MDC（%）0.48±0.16 0.28±0.09 7.349＜0.001 IL-32 mRNA 2.16±0.71 1.06±0.33 9.306＜0.001 CARD9蛋白0.46±0.13 0.35±0.11 4.605＜0.001 IL-32蛋白0.24±0.06 0.17±0.05 6.374＜0.001

2.2 各檢測指標診斷UC 的ROC

ROC 曲線顯示，單一中MDC 的AUC 0.901（95%CI：0.833～0.947）最大；各指標聯合的AUC 0.920（95%CI：0.857～0.962）大于任一單一指標。見表2、圖1。

表2 ROC 分析結果Table 2 ROC analysis results

圖1 各檢測指標診斷UC 的ROCFigure 1 ROC of each test index to diagnose UC

2.3 UC 患者不同病情程度者各檢測指標比較

活動期患者CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA、CARD9蛋白、IL-32 蛋白高于緩解期（P＜0.05），隨著活動期患者病情程度加重，CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA、CARD9 蛋白、IL-32 蛋白依次增高，兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 UC 患者不同病情程度者各檢測指標比較（±s）Table 3 Comparison of various detection indexes of UC patients with different disease severity（±s）

表3 UC 患者不同病情程度者各檢測指標比較（±s）Table 3 Comparison of various detection indexes of UC patients with different disease severity（±s）

注：與緩解期比較，aP＜0.05；與輕度比較，bP＜0.05；與中度比較，cP＜0.05。

組別活動期輕度中度重度緩解期F 值P 值例數56 19 21 16 26 CARD9 mRNA 0.97±0.25a 0.70±0.18 0.98±0.24b 1.28±0.27bc 0.59±0.16 28.779＜0.001 MDC（%）0.59±0.12a 0.34±0.11 0.60±0.13b 0.87±0.15bc 0.24±0.10 86.265＜0.001 IL-32 mRNA 2.67±0.54a 1.49±0.44 2.06±0.51b 4.87±0.60bc 1.06±0.32 169.266＜0.001 CARD9蛋白0.52±0.11 0.31±0.12 0.57±0.14 0.70±0.13 0.33±0.10 39.571＜0.001 IL-32蛋白0.29±0.08 0.14±0.04 0.28±0.06 0.48±0.09 0.13±0.04 83.6900＜0.001

2.4 各檢測指標與病情程度相關性

以UC 活動期患者各指標為源數據，采用Spearman 進行相關性分析，結果顯示，CARD9mRNA（r=0.808，P＜0.001）、MDC（r=0.815，P＜0.001）、IL-32mRNA（r=0.874，P＜0.001）、CARD9 蛋白（r=0.735，P＜0.001）、IL-32 蛋白（r=0.803，P＜0.001）均與病情程度呈正相關。

2.5 多分類Logistic 回歸方程分析

以病情程度為因變量（1=輕度，2=中度，3=重度），納入CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 指標作為自變量（各指標賦值：1=低于UC 組均值，2=高于UC 組均值），應用多分類Logistic 回歸方程分析，結果顯示，CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA是UC 患者病情程度的相關獨立影響因素（P＜0.05）。見表4。

表4 Logistic 回歸方程分析Table 4 Multi-class Logistic Regression Equation

3 討論

CARD9mRNA 在人體脾、肝、外周淋巴細胞等免疫組織中廣泛表達，包含行使蛋白募集功能的胱天蛋白募集域和行使蛋白質寡聚化功能的卷曲螺旋域，能通過與B 細胞淋巴瘤因子-10、絲裂原活化蛋白激酶等作用，有效整合多種固有免疫受體識別信號，正常情況下，在小腸和結腸中處于低表達狀態［8］。杜曉博等［9］報道，CARD9 蛋白在炎癥性腸病患者腸組織中表達高于正常腸組織，與患者病情程度呈正相關，本研究觀點與之相似，但本研究檢測的是PBMC 中CARD9mRNA 和CARD9 蛋白表達，無需有創性獲取腸組織標本，更具臨床實際應用價值。UC 是慢性、反復發作性腸道炎癥反應，而CARD9mRNA 是腸道固有免疫反應中重要銜接物質，能通過與肽聚糖反應增加腫瘤壞死因子、白介素-6 等炎癥介質產生，對腸黏膜造成炎性損傷，破壞腸黏膜屏障作用，影響腸道免疫系統對微生物抗原耐受情況，從而引起錯誤的免疫反應和炎性反應，參與UC 發生與進展［10］。同時UC 患者糞便和黏膜中總真菌負荷增加，CARD9mRNA和CARD9蛋白升高有利于馬拉色菌定植，從而加劇腸道炎癥［11］。

骨髓細胞，尤其單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，在先天免疫以及適應性免疫的啟動和維持中起著至關重要作用［12］。重度UC 患者治療前PBMC 中MDC 處于高水平狀態，治療后有效患者則明顯降低，若持續升高，提示預后不良，佐證了MDC 在UC 病情和預后評估中的作用［13］。MDC 是髓樣樹突狀細胞，具有抗原提呈作用，可經淋巴管將抗原提呈給未致敏的T 淋巴細胞，使T 淋巴細胞異常激活及腸道黏膜中髓系細胞浸潤，介導腸黏膜的免疫炎癥損傷，破壞腸黏膜的固有免疫反應，因此與UC 發生和病情進展有關。當PBMC 中MDC＞0.39%時，診斷UC 的AUC 為0.901，敏感度為87.80%，特異度為82.50%，能為臨床無創性、簡便性診斷UC 提供參考。

IL-32mRNA 參與自然殺傷細胞正常功能、單核細胞分化、角質細胞凋亡、樹突細胞成熟的調節［14］。本研究顯示，UC 患者IL-32mRNA 高于健康人群，與羅莉蕓等［15］報道一致，提示IL-32mRNA 與UC 發病有關。IL-32mRNA 能通過激活核轉錄因子-kB 和P38 絲裂原活化蛋白激酶途徑誘導單核細胞產生白介素-8、腫瘤壞死因子，并能誘導PBMC產生白介素-6、白介素-1β，而生白介素-8、腫瘤壞死因子、白介素-6、白介素-1β 均是UC 中重要的炎性細胞因子，能使炎癥區域聚集大量的異常致敏的T 細胞，導致腸黏膜潰瘍，加重腸黏膜炎癥損傷，所以與UC 發病及病情進展有關。另聯合應用的ROC 分析顯示，聯合檢測CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 診斷UC 的AUC高于單一指標，故建議條件允許時，聯合檢測三者，從而為臨床診斷提供更可靠的參考。

綜 上，UC 患 者PBMC 中CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA、CARD9 蛋白、IL-32 蛋白顯著升高，并與病情程度有關，聯合檢測CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 能為臨床診斷UC 及評估UC 病情提供參考。