丹膝顆粒HPLC 指紋圖譜的建立

劉燦黃，何清彥，吳勝男，林麗美，夏伯候，黃勝

1.長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.九芝堂股份有限公司，湖南 長沙 410205

丹膝顆粒原名“偏癱靈顆?！?，收載于《中國藥典》2020年版一部［1］，為九芝堂獨家生產品種，臨床上對陰虛風動型和氣虛血淤型中風偏癱有其特有的預防和治療優勢［2-4］。全方由丹參、牛膝、天麻、牡丹皮、赤芍、川芎、生地黃、淫羊藿、桑寄生、梔子、決明子、火麻仁12 味藥材組成，丹膝顆粒原質量標準建立了丹參、牛膝、淫羊藿、梔子、決明子的薄層色譜鑒別和丹酚酸B、天麻素的高效液相含量測定方法，薄層色譜和含量測定項目多而且前處理方法繁雜，影響因素較多。目前尚沒有文獻報道有關丹膝顆粒指紋圖譜的研究，本研究通過高效液相色譜法，DAD 檢測器和ELSD 檢測器兩個檢測器串聯［5-6］，建立丹膝顆粒HPLC-DAD-ELSD 雙通道指紋圖譜，較為直觀、簡單呈現丹膝顆粒整體化學成分，為科學評價及有效控制丹膝顆粒的質量提供可靠方法。

1 儀器與試藥

島津LC-20AD 高效液相色譜儀，SPD-M20A檢測器，ELSD-LT Ⅱ蒸發光散射檢測器；SIL-20A自動進樣器，LCsolution 色譜工作站，電子天平METTLER TOLEDO XS205DU，新芝SB-800 DTD 超聲儀。

對照品及對照藥材：沒食子酸（批號：110831-201906，91.5%），梔子苷（批號：110749-201718，97.6%），丹酚酸B（批號：110562-201917，96.6%），淫羊藿苷（批號：110737-202017，98.1%），丹皮酚（批號：110708-201908，99.8%），丹參酮ⅡA（批號：110766-202022，98.9%），芍藥苷（批號：110736-201943，95.1%），丹參素（批號：20101，99.3%），人參皂苷Ro（批號：20051，96.0%），橙黃決明素（批號：20031，98.0%），丹參（批號：120923-201816），牡丹皮（批號：121490-201603），丹參素、人參皂苷Ro、橙黃決明素對照品購自珠海安哲生物科技有限公司，其余對照品、對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院，試劑甲醇、甲酸為分析純，水（超純水），乙腈（色譜純）。丹膝顆粒（規格：每袋裝10 g）15批樣品由九芝堂股份有限公司提供，按照藥典標準項目檢驗合格。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液精密稱取沒食子酸、梔子苷、丹酚酸B、淫羊藿苷、丹皮酚、丹參酮ⅡA對照品適量，至棕色量瓶中，加甲醇制成濃度分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.05 mg/mL、0.015 mg/mL、0.015 mg/mL的對照品溶液1。精密稱取丹參素、芍藥苷、人參皂苷Ro、橙黃決明素對照品適量，至棕色量瓶中，加甲醇制成濃度分別為0.10 mg/mL、0.015 mg/mL、0.015 mg/mL、0.015 mg/mL的對照品溶液2。

2.1.2 供試品溶液樣品研細，取粉末約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱定重量，超聲提?。üβ?50 W，頻率40 kHz）45 min，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 對照藥材溶液按處方量及制備工藝，依照“2.1.2”項下的方法進行處理，分別制備丹參、牡丹皮對照藥材溶液。

2.2 色譜條件

CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～65 min，5%→30%A；65～120 min，30% →90%A；120～121 min，90%→5%A；121～135 min，5%A）；流速：0.8 mL/min；柱溫35 ℃，進樣量10 μL，分析時間135 min，DAD（190 nm～400 nm）檢測；ELSD 條件：漂移管溫度45 ℃，氣體流量1.5 L/min，增益9。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC-DAD-ELSD色譜圖

2.3 指紋圖譜方法學考察

2.3.1 精密度試驗取同一供試品溶液，在上述色譜條件下連續進樣測定6 次，分別測得DAD、ELSD下各共用峰保留時間和相對峰面積的RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗取同一供試品溶液，在上述色譜條件下0 h、15 h、30 h、45 h、60 h、75 h、90 h 依次測定，分別測得DAD、ELSD 下各共用峰保留時間和相對峰面積的RSD 均小于2.0%，表明供試品溶液90 h 內穩定。

2.3.3 重復性試驗取同一批號樣品6 份，依照“2.1.2”項下的方法進行處理，在上述色譜條件下依次測定，分別測得DAD、ELSD 下各共用峰保留時間和相對峰面積的RSD 均小于2.0%，表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 共有峰歸屬取對照品溶液1、對照品溶液2依法進樣測定，記錄色譜圖，與指紋圖譜各主要峰對比，標示17 個共有峰，DAD 檢測器下1 號峰為沒食子酸、2 號峰梔子苷、3 號峰丹酚酸B、4 號峰淫羊藿苷、5 號峰丹皮酚、9 號峰丹參酮ⅡA，ELSD檢測器下11 號峰為丹參素，13 號峰為芍藥苷，16號峰為人參皂苷Ro，17 號峰為橙黃決明素。通過參考丹參對照藥材溶液和牡丹皮對照藥材溶液色譜圖，6 號峰、7 號峰、8 號峰為丹參脂溶性成分，12號峰、14 號峰，15 號峰為牡丹皮中成分，10 號峰未知，具體化合物需進一步質譜確認。2 號峰梔子苷、3 號峰丹酚酸B、4 號峰淫羊藿苷及9 號峰丹參酮ⅡA在ELSD 下同樣有較強檢測信號，但其紫外吸收明顯，故選用DAD（254 nm）下標識檢測，在ELSD 檢測器下未標識。色譜圖見圖1。

2.4.2 指紋圖譜建立及相似度分析取15批次樣品各適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依法進樣測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723 版）進行分析，建立雙通道串聯指紋圖譜（參考圖譜：S1，對照圖譜生成方法：中位數，時間窗寬度：0.1 min），生成對照圖譜，多點校正法建立指紋圖譜，指紋圖譜、對照指紋圖譜見圖2、圖3。共標示17 個共有峰，DAD 檢測器（254 nm）下相似度在0.961～0.998，ELSD 檢測器下相似度在0.965～0.999。15批樣品相似度整體分布均在0.95 以上，表明相似度良好。

圖2 HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜：A.HPLC-DAD；B.HPLC-ELSD

圖3 HPLC-DAD-ELSD對照指紋圖譜：A.HPLC-DAD；B.HPLC-ELSD

3 討論

3.1 DAD 檢測波長和ELSD 檢測的選擇

實驗通過DAD 檢測器200～400 nm 全波段掃描，分析色譜結果時分別比較了芍藥苷、梔子苷、淫羊藿苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA等成分的最大吸收波長處（如210 nm、230 nm、238 nm、254 nm，270 nm，286 nm，320 nm）下整體樣品峰信息，最后選擇波長254 nm 下樣品整體檢測信號豐富、靈敏度較高，便于整體評價。DAD 檢測器下對沒食子酸、梔子苷、丹酚酸B、淫羊藿苷、丹皮酚、丹參酮ⅡA等10 個成分進行了標識檢測，為進一步加強對丹膝顆粒質量的整體控制，彌補在DAD 檢測器下有些成分含量低、紫外吸收不明顯的缺點［7］，選擇樣品從DAD 檢測器檢測流出后再進入ELSD 檢測器同步檢測，ELSD 檢測器下標識人參皂苷Ro、橙黃決明素等6 個共有峰。

3.2 供試品溶液制備、流動相系統、流動相比例的選擇

考察了不同提取溶劑（50%甲醇，70%甲醇，100%甲醇）；不同提取方法（超聲45 min，回流提取30 min，回流提取1 h）。以100%甲醇提取、超聲45 min 時，方法較簡單且目標成分提取率較高，提取完全，各檢測信息相對穩定，分離效果較好。流動相體系考慮了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%甲酸溶液、乙腈-0.05%甲酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液［8-10］。其中加0.05%甲酸溶液和0.05%磷酸溶液均優于純水體系，因考慮用ELSD檢測器，選擇了易揮發的0.05%甲酸溶液；因樣品中成分極性范圍寬，有些成分出峰時間慢，成分多且復雜，故最終選擇乙腈-0.05%甲酸溶液流動相，分離度相對較好且基線平穩。并對流動相比例進行了優化［11-15］，最終按照“2.2”項下梯度洗脫的流動相比例。

3.3 指紋圖譜分析

本研究指紋圖譜17 個共有峰分別為1 號峰沒食子酸、2 號峰梔子苷、3 號峰丹酚酸B、4 號峰淫羊藿苷、5 號峰丹皮酚、9 號峰丹參酮ⅡA、11 號峰丹參素、13 號峰芍藥苷、16 號峰人參皂苷Ro、17 號峰橙黃決明素，以上成分分別來源于丹參、赤芍、牡丹皮、梔子、淫羊藿、牛膝、決明子。6、7、8 號峰分別來源于丹參，12、14、15 號峰分別為來源于牡丹皮。共有峰的相對保留時間穩定，方法學考察精密度、穩定性、重復性均符合要求，相似度結果符合要求。

本研究為生產企業對丹膝顆粒的整體年度質量回顧、監管部門對丹膝顆粒整體質量監控、科學評價丹膝顆粒的整體質量提供參考方法。