轉錄輔助激活因子p300通過調控TGF-β/Smad3信號通路參與高靜水壓誘導的心房纖維化

余聲歡，曾瓏，饒 芳，肖海茵，鄧春玉，薛玉梅，吳書林，魏 薇

(1.華南理工大學醫學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省心血管病研究所心內科， 廣東省人民醫院醫學研究部，廣東省醫學科學院，廣東 廣州 510080)

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的持續性心律失常，在一般人群中患病率達1%-2%，且隨著人口老齡化和心血管疾病生存率的增加，其發病率呈逐年上升趨勢[1]。結構重塑是AF發生的主要病理機制之一，成纖維細胞活化，結締組織沉積加劇和纖維化是心房結構重構的標志[2]。高血壓(hypertension，HTN)是AF的獨立危險因素，心房高壓對AF及其并發癥的發生起著重要的作用，但心房高壓在AF發生中的作用機制仍不清楚。

心血管系統承受3種機械應力，包括剪切應力、牽張力和靜水壓[3]。心血管靜水壓是指血流對單位面積血管的側壓力。HTN時心房內包括靜水壓在內的機械應力增加，導致心房肌細胞的拉伸和壓力增加，心房舒張和收縮功能障礙，進一步導致心房重塑及AF的發生。我們課題組前期研究表明，高靜水壓培養的心房肌細胞株(HL-1細胞)，腎素-血管緊張素系統和黏著斑激酶-Src信號通路激活[4]。我們研究發現，高壓直接刺激可誘導野生型Wistar大鼠心房成纖維細胞的分泌和增殖，Smad3/轉化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)信號通路介導此過程[5]。

1 材料與方法

1.1 人組織標本本研究基于赫爾辛基宣言中闡述的原則，經我院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。有肺炎或其它感染性疾病者不入選。本研究共入選25例患者，收集竇性心律(sinus rhythm，SR)和AF不合并HTN患者各8例，AF合并HTN者9例，SR患者心耳由器官捐獻者提供，AF和AF合并HTN患者的左心耳組織來自AF外科消融手術經胸腔鏡切除，心耳組織置于冰盒中運送至實驗室，分裝至EP管中，儲存于-80 ℃，用于蛋白檢測。

1.2 實驗動物SPF級C57BL/6小鼠，♂，8-12周齡，體質量(20-30)g。由廣東省廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2013-0034。心耳成纖維細胞由小鼠心耳分離獲取，傳至p2代細胞用于實驗。本研究所有人體及動物實驗已通過廣東省人民醫院(廣東省醫學科學院)的醫學研究倫理審查(201904010451)。

1.3 主要試劑特級澳洲胎牛血清、DMEM-F12培養基和0.25% EDTA-胰蛋白酶(Gibco)；姜黃素(Cayman)；脫脂奶粉(BD);二甲基亞砜、4× SDS上樣緩沖液(Sigma);聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和抗p300抗體(Millipore)；抗Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(collage typeⅠα1 chain，Col-1A1)抗體；抗Ⅲ型膠原蛋白α1鏈(collage type Ⅲ α1 chain，Col-3A1)抗體；抗Smad3抗體；抗p-Smad3抗體(Abcam)；抗基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)抗體；抗基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)抗體；抗TGF-β抗體(Cell Signaling Technology)；抗GAPDH抗體(Proteintech)；p300小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和陰性對照(上海吉凱基因科技有限公司); CCK-8試劑盒(同仁);其它生化試劑均為進口分裝或者國產純化。

1.4 細胞培養和傳代使用0.25% EDTA-胰蛋白酶，從8-12周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠取左心耳進行消化，差速貼壁法分離出心耳成纖維細胞，采用含10% FBS、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM-F12培養基置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。從培養瓶中吸出舊培養基，用2 mL PBS沖洗細胞2次，加入0.25%胰酶消化約1 min，加入含血清的培養基中和，用移液槍吹打培養皿使細胞脫落，200×g離心5 min，1 ∶2分裝入新的培養皿。

1.5 細胞干預C57BL/6小鼠消化分離的心耳成纖維細胞傳至p2代，將細胞接種于60 mm培養皿中置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，待細胞密度達到70%-80%，將細胞分別置于0、20和40 mmHg靜水壓中培養24 h后收皿。C57BL/6小鼠消化分離的心耳成纖維細胞傳至p2代，將細胞接種于60 mm培養皿中，待細胞密度達到70%-80%，換液后分別加入濃度為3 μmol·L-1和10 μmol·L-1的姜黃素干預，放入37 ℃、5% CO2、40 mmHg壓力的高壓培養箱繼續培養24 h后收皿，用于后續實驗。將C57BL/6小鼠消化分離的心耳成纖維細胞傳至p2代，將細胞接種于60 mm培養皿中，待細胞密度達到70%-80%，進行轉染操作。5 μg p300 siRNA、助轉染劑p3000與相應體積Opti-MEM培養基充分混合，10 μL Lipofectamine 3000試劑與相應體積的Opti-MEM培養基充分混合。然后將分別含有p300 siRNA和Lipofectamine 3000脂質體的溶液充分混勻，室溫下孵育15 min后放入37 ℃、5% CO2、40 mmHg壓力的高壓培養箱繼續培養，24 h后收皿，用于后續實驗。

1.6 Western blot通過細胞或剪碎研磨的組織內加入適量RIPA裂解液，同時加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，收集裂解液，10 000 ×g離心15 min，取上清，分裝后儲存于-80 ℃。BCA法測定蛋白濃度后，4 × SDS上樣緩沖液稀釋后的30 μg樣本，55 ℃加熱10 min變性。8% SDS-PAGE分離蛋白，然后轉至PVDF膜。TBST-脫脂牛奶室溫下封1 h，加入相應I抗[p300(1 ∶1 000)、Col1A1(1 ∶2 000)、Col3A1(1 ∶2 000)、MMP-2(1 ∶2 000)、MMP-9(1 ∶1 000)、Smad3(1 ∶1 000)、p-Smad3(1 ∶1 000)、TGF-β(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶10 000)]，4 ℃過夜。TBST洗3次，每次10 min。根據I抗來源種屬選擇合適的II抗(辣根過氧化物酶標記的抗兔或抗小鼠IgG)，5 %脫脂奶粉1 ∶1 000比例稀釋，室溫孵育1 h。TBST洗3次，每次5 min。ECL試劑盒顯影蛋白條帶，ImageJ軟件定量分析蛋白灰度值，計算比值進行統計分析。

1.7 CCK-8原代分離的成纖維細胞傳至p2代，將細胞懸液接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL，分別置于不同靜水壓的壓力培養箱中培養24 h后更換培養液，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育4 h后在450 nm波長處測定吸光度。

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2 結果

2.1 HTN合并AF患者左心耳組織p300及纖維化相關指標表達升高Western blot檢測SR、單純AF和HTN合并AF 3組患者左心耳組織的p300及TGF-β/Smad3信號通路相關蛋白TGF-β、Smad3/p-Smad3及下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達。HTN合并AF組患者p300表達比單純AF患者和SR患者明顯升高(Fig 1A, C)，而單純AF組患者p300表達比SR組患者也明顯升高(Fig 1A, C)。同時，HTN合并AF組患者纖維化相關蛋白表達高于單純AF患者和SR患者(Fig 1)，而單純AF組患者纖維化相關蛋白表達高于SR患者(Fig 1)，HTN合并AF組患者磷酸化Smad3(p-Smad3)和Smad3的比值p-Smad3/Smad3高于AF組和SR組(Fig 1B)，而AF組患者p-Smad3/Smad3的比值高于SR組(Fig 1B)。以上結果表明，HTN合并AF患者左心耳組織的p300表達明顯升高，TGF-β/Smad3信號通路激活，同時伴隨著下游纖維化相關蛋白的表達升高。

2.2 高靜水壓可刺激小鼠心耳成纖維細胞p300及纖維化指標表達升高為了驗證高靜水壓刺激能否促進心房成纖維細胞分泌p300和纖維化相關蛋白，使用酶解分離法消化差速貼壁分離8-12周齡C57BL/6小鼠原代心耳成纖維細胞，傳至p2代分別置于0、20和40 mmHg梯度壓力下培養，模仿心房內壓力增高，Western blot檢測p300和TGF-β/Smad3及下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達。結果顯示，與0 mmHg組相比，20 mmHg靜水壓下上述指標有上升趨勢，但差異無統計學意義，而40 mmHg高靜水壓可促進小鼠心耳成纖維細胞p300表達升高(Fig 2A, C)。同時，40 mmHg高靜水壓刺激亦可促進心房成纖維細胞的Col-1A1、MMP-2/9、Smad3/p-Smad3和TGF-β的表達明顯升高(Fig 2)，其中20和40 mmHg靜水壓組p-Smad3/Smad3的比值與0 mmHg組相比有增加趨勢(Fig 2B)，但3組組間差異均無統計學意義。因此，在高靜水壓下，小鼠心耳成纖維細胞p300表達升高，TGF-β/Smad3信號通路激活，同時伴隨著下游纖維化相關蛋白的表達升高。

2.3 姜黃素可逆轉高靜水壓引起的p300及纖維化指標升高為探索p300是否參與高靜水壓引起的成纖維細胞分泌活化，使用不同濃度的p300 HAT抑制劑-姜黃素(3 μmol·L-1和10 μmol·L-1)干預小鼠原代心耳成纖維細胞，干預后置于40 mmHg壓力下培養24 h，Western blot檢測p300蛋白及TGF-β/Smad3信號通路蛋白和下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達。結果顯示，與單純壓力組相比，高濃度(10 μmol·L-1)姜黃素抑制p300可以逆轉高靜水壓誘導的TGF-β/Smad3信號通路蛋白和下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達升高(Fig 3)，同時也可以逆轉降低p-Smad3/Smad3的比值(Fig 3B)。這提示，p300在高靜水壓誘導的心房纖維化中可能通過調控TGF-β/Smad3信號通路發揮作用。

Fig 1 Increased expression of p300 and fibrotic factors in left atrial appendage tissues of patients in HTN combined with AF group

Fig 2 Expressions of p300 and fibrotic factors in fibroblasts increased by high hydrostatic pressure

2.4 p300 siRNA敲低p300表達逆轉壓力引起的纖維化指標升高使用p300 siRNA敲低小鼠原代心耳成纖維細胞的p300，分別置于0 mmHg和40 mmHg壓力下培養，Western blot檢測p300和TGF-β/Smad3信號通路相關蛋白及下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達。結果顯示，小鼠心耳成纖維細胞在加入p300 siRNA后，高靜水壓下p300及TGF-β/Smad3信號通路蛋白和下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達升高得以逆轉(Fig 4)，同時p-Smad3/Smad3的比值有降低的趨勢(Fig 4B)。因此，p300 siRNA敲低p300表達同樣可以調控TGF-β/Smad3信號通路，逆轉壓力引起的纖維化指標升高。

2.5 姜黃素可逆轉高靜水壓誘導的小鼠心耳成纖維細胞增殖使用CCK-8法檢測不同靜水壓對原代小鼠心耳成纖維細胞增殖的影響，結果顯示，20 mmHg和40 mmHg靜水壓培養小鼠心耳成纖維細胞可促進其增殖(Fig 5A)，在40 mmHg 靜水壓下培養的成纖維細胞中加入10 μmol·L-1的p300抑制劑姜黃素后，可逆轉高靜水壓對成纖維細胞的促增殖作用(Fig 5B)。

3 討論

本研究發現，AF患者左心耳組織中，p300及TGF-β/Smad3信號通路相關蛋白TGF-β、p-Smad3/Smad3及下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達和p-Smad3/Smad3蛋白表達的比值較SR者升高，合并HTN的AF患者心房組織上述指標表達較單純AF患者和SR者高。在細胞層面，給予高靜水壓可使小鼠心耳成纖維細胞增殖活力增加及p300和TGF-β/Smad3信號通路相關蛋白及下游纖維化因子表達增加；抑制p300的活性和表達可以逆轉高靜水壓誘導的TGF-β/Smad3信號通路蛋白和下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達。證明p300表達參與了高靜水壓所致的心房纖維化，其作用機制可能是通過調控TGF-β/Smad3信號通路。

Fig 3 Curcumin reversed increase of p300 and fibrotic factors in fibroblasts caused by high hydrostatic pressure

AF與HTN密切相關，長期HTN引起心室僵硬度增加和收縮舒張功能障礙，引起左心房內的機械應力升高，心房超負荷引起心房結構重塑和電重塑，導致AF的發生。正常人的左房壓力約8-12 mmHg，有研究指出，AF時有34%的患者左房壓升高[9]，HTN時左房壓力也升高。HTN可導致心房發生成纖維細胞活化在內的結構重構，從而進一步導致心房纖維化。心房纖維化在心律失常折返的維持中發揮了中心作用，AF患者纖維組織的含量和分布不僅與AF的機制有關，而且與AF的并發癥和治療失敗風險相關[10]。目前，心房高壓致心房纖維化的具體機制尚不明確。心血管系統承受機械應力在AF發病的細胞機制方面的研究，主要集中在牽張力對心房肌細胞結構重構和電重構的影響[11]，這些研究通過利用硅膠膜對細胞進行拉伸，模擬細胞在高牽張力下的病理狀態，但忽略了靜水壓的作用，高靜水壓對細胞的作用值得進一步研究。少量文獻報道了靜水壓對心房重構的影響，有研究表明，在80-160 mmHg的高靜水壓培養Wistar大鼠心肌細胞60 min，可誘導心肌細胞早期肥大反應標志c-fos mRNA表達升高[12]。另有研究發現，在180 mmHg高靜水壓培養的大鼠心肌H9c2細胞中，高靜水壓通過激活G蛋白偶聯受體Apelin上調磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路調節自噬，并促進心肌細胞的肥大[13]，以上研究所采用的模型均為心肌細胞，成纖維細胞較少受到關注。心臟成纖維細胞占所有心臟細胞的30%，通過分泌膠原蛋白、彈性蛋白、原纖蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和基質金屬蛋白酶維持結締組織穩態，異常的成纖維細胞活化和分化為肌成纖維細胞導致膠原蛋白及其它細胞外基質過度沉積及和病理性纖維化[14]。我們原代分離小鼠心耳成纖維細胞，并使用我們課題組自行研制的可以提供和維持一定壓力的裝置(專利號：ZL 2014 20109263.1)，更好地模擬心房高壓的病理環境。正常人的左房壓力約8-12 mmHg，本研究使用20 mmHg模擬心房內較高壓力環境，40 mmHg模擬心房的更高壓力環境。

Fig 4 Knockdown of p300 expression reversed increase of fibrotic factors in fibroblasts caused by high hydrostatic pressure

Fig 5 Curcumin reversed proliferation of mouse atrial appendage fibroblasts induced by high hydrostatic pressure

轉錄輔助激活因子p300具有內在乙酰轉移酶活性，但與轉錄因子不同，p300不直接與DNA結合，通過乙?；M蛋白和非組蛋白包括轉錄因子來調控轉錄[6]。p300在表觀基因調控中起的作用主要是通過乙?；M蛋白實現的，HAT結構域通過乙?；M蛋白，組蛋白H2A-H2B二聚體從核小體移至組蛋白伴侶，松弛染色質結構，促進DNA與轉錄因子結合[15]。有研究表明，在正常皮膚和肺成纖維細胞中異位表達p300可以增強TGF-β/Smad3通路介導的Col-1A2啟動子的活性，而使用HAT缺失的p300轉染成纖維細胞對Col-1A2啟動子的活性的影響則明顯降低[16]。另有研究顯示，p300抑制劑L002可抑制HTN所致的心臟和腎臟纖維化，主要機制是通過抑制血管緊張素Ⅱ(angiotensn Ⅱ，AngⅡ)/TGF-β介導的p300上調，進而抑制組蛋白乙?；蚐mad的磷酸化[7]。本研究結果發現在單純AF和HTN合并AF患者心耳組織以及在高靜水壓細胞模型中，p300表達升高，同時纖維化蛋白表達也升高，提示p300在高靜水壓誘導的心房纖維化中發揮重要作用。

姜黃素是從姜黃中提取的黃色結晶物質，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗真菌、抗細菌和抗癌等多種功效。從姜黃中分離的主要有姜黃素，去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin，DMC)和雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycuecumin，BDMC)3種姜黃素類似物，3種姜黃素均有相似的p300 HAT特異性抑制作用。有研究發現，用姜黃素或姜黃素類似物DMC和BDMC預處理原代乳大鼠心肌細胞，可抑制去氧腎上腺素誘導的心肌肥大[17]。姜黃素作為p300 HAT特異性抑制劑，可以通過抑制p300乙?；富钚哉{節纖維化相關因子表達，其作為食用色素廣泛用于食品工業。在本研究中，姜黃素預處理小鼠心耳成纖維細胞后置于40 mmHg靜水壓下培養，結果顯示姜黃素抑制了成纖維細胞中p300蛋白的表達，同時纖維化相關因子表達也下降，且高濃度姜黃素處理組p300和纖維化相關因子的表達下降更加明顯。本研究進一步驗證了p300在高靜水壓誘導的心房纖維化中發揮重要作用。姜黃素為p300 HAT特異性抑制劑，但其作用廣泛，為了進一步明確p300在高靜水壓中對心房纖維化的特異性作用，本研究使用p300 siRNA特異性敲低p300的表達，發現結果與姜黃素處理一致，在p300表達被敲低后，纖維化相關因子表達也下降，進一步驗證了p300在加壓條件下對纖維化相關因子表達的調控作用。

本研究還對p300參與高靜水壓致心房纖維化的可能分子機制進行了初步的研究。TGF-β/Smad3信號通路是纖維化的經典通路，TGF-β是公認的纖維化相關蛋白，TGF-β通過與轉化生長因子受體II相互作用，招募并磷酸化轉化生長因子受體I，磷酸化Smad3蛋白，p-Smad3是Smad3蛋白的活化形式，與Smad4結合后入核，調控包括纖維化相關蛋白基因在內的目標基因轉錄，而未磷酸化的Smad3則在胞漿內以非活化形式存在[18]。因此p-Smad3蛋白表達水平的高低和p-Smad3與Smad3的比值是反映TGF-β/Smad3信號通路的激活強度重要標志。本研究結果顯示，單純AF和HTN合并AF患者組織和高靜水壓細胞模型的TGF-β/Smad3信號通路被激活，其相關蛋白TGF-β、p-Smad3和未活化的Smad3蛋白表達均升高，p-Smad3/Smad3的比值同時也有升高的趨勢。這提示p300在高靜水壓誘發心房纖維化中發揮作用可能與TGF-β/Smad3信號通路有關。在高靜水壓細胞模型中加入姜黃素后，TGF-β、p-Smad3和Smad3蛋白表達降低，同時p-Smad3/Smad3的比值降低。進一步使用p300 siRNA敲低p300的表達后，TGF-β、p-Smad3和Smad3蛋白表達降低，p-Smad3/Smad3的比值亦有降低的趨勢。這提示，p300通過調控TGF-β/Smad3信號通路參與了高靜水壓所致的心房纖維化。

綜上，本研究在人組織中驗證了HTN可促p300和纖維化相關因子的分泌增加。在細胞層面建立了小鼠心耳成纖維細胞高靜水壓模型，驗證了成纖維細胞在加壓條件下p300和纖維化相關因子的分泌增加和增殖活力增加，同時驗證了p300對細胞增殖和纖維化因子分泌的調控作用及可能機制。本研究拓展了我們對HTN誘發心房纖維化的機制的認識，證實在高靜水壓條件下p300可以調控纖維化相關因子，有望成為預防和治療心房纖維化的新靶點。