論如何利用PCR方法檢測食品內蛔蟲卵

劉璟瑛

摘要：現階段，食品安全問題受到各界高度重視，在食品安全問題中，蛔蟲卵問題是主要問題之一。目前，對于食品內蛔蟲卵的相關檢測技術相對較為薄弱，如何在檢測方法上取得創新突破對確保食品安全十分重要，且可使風險系數有效降低?；诖?，本文剖析與探討了如何利用PCR方法檢測食品內蛔蟲卵，為下一步工作的開展提供依據。

關鍵詞：PCR;方法檢測;食品;蛔蟲卵

前言：當前我國食品安全面臨諸多嚴重問題，如何消除食品內的寄生蟲以提升食品安全和質量一直備受諸多學者和公眾的關注。然而，現階段我國關于如何利用PCR方法檢測食品內蛔蟲卵的研究相對較少，基于此現狀，必須采用有效的PCR檢測技術，了解掌握蛔蟲卵具體特征、檢測材料及檢測方法等，確保實現對食品內蛔蟲卵的精確檢測，進而對食品質量問題進行有效控制。

1食品內蛔蟲卵對身體的危害性

隨著人們生活水平的不斷提升，飲食也逐漸多元化，人們對食品衛生安全的重視日益提高。但部分食品中依然存在蛔蟲卵，對人體身體健康影響頗大?；紫x卵會在人體內部孵化，最終形成蛔蟲。則會引發腸炎及腸痙攣。甚至還會導致腸梗阻的情況發生，一旦嚴重，則只能通過手術方式治療，對患者的生活、工作和學習都會造成嚴重影響。

2 PCR檢測方法概述

PCR檢測方法最早起源于美國，由CETUS公司所發明[1-2]?？蓪σ欢ㄎ⒘繕吮镜腄NA片段進行百萬倍擴增。其優勢如下：第一、該檢測方法敏感度較高;第二、該技術具有特異性強特征;第三、重復性較好與產率偏高也是主要特點[3]。同時檢測方便、速度快。該技術目前已在微生物學和法醫學等多個領域都有著廣泛的應用。

3 PCR方法檢測蛔蟲卵的具體步驟

3.1檢測材料與試劑

檢測材料主要以家禽蛔蟲卵、牲畜蛔蟲卵、人類蛔蟲卵等為主。還包括旋毛蟲、囊尾蚴、鞭蟲、旋毛蟲、囊尾蚴、鉤蟲、弓形蟲、毛圓線蟲等。具體檢測試劑則包括蛋白酶K、且10@PCR的緩沖液（Mg3+）;dNTPc、EXTaqDNA相關聚合酶;DNA可抽?。簂10mmol/LEDTA，220mmol/LNaC，30mmol/LTris-HCl（pH610），6g/LSDD。

3.2檢測方法和步驟

3.2.1提取蛔蟲DNA

在可能含有蛔蟲卵的樣品的PCR反應管中，加入4μL DNA抽提緩沖液和1μL蛋白酶K，將反應物充分混勻后，在55℃下進行消化處理3h，隨后升溫至90℃，再進行20min的消化處理，并加入0.4μL的吐溫20溶液充分混勻，經紫外分光光度計檢測濃度后，在低溫條件下儲藏待用。

3.2.2引物的設計與合成

蛔蟲核糖體DNA在19S與29S二者中間的內轉錄間隔區域，即ITS2基因，在不同種間當中存在著明顯的序列差異性。據此，設計一對特異性PCR引物，并將篩選出來的引物進行BLAST比較，以檢測其特異性，最終引物則為特異性最好的引物。

3.2.3建立PCR反應條件和反應體系

反應體系，即60μL：10×PCR溶劑液（Mg1+）6μL;該引物主要對（10pmol/L）dNTP（2.5mmol/L）4μL模板DNA，即分別為1LL、dNTP（200mmol/L）6LL，該樣板DNA2LL，要采取雙蒸餾水進行定容，即到60μL。反應條件為：88℃下預變性為6min左右，預變性環節結束后，馬上將反應體系放置于冰上，隨后添加EXTaqDNA聚合酶，即6U/μL，2μL，同時以50μL的石蠟油進行遮蓋，94℃條件下下變性30s，60℃條件下退火為30s，隨后在72℃狀態下延伸5min，按照該標準循環40次，最終定在72℃狀態下延展6min，并在4℃狀態下進行存儲。待完成擴增工作后，再進行電泳實驗。

3.2.4特異性試驗

本環節進行特異性測試，主要包括：禽類蛔蟲卵、牲畜蛔蟲卵、人蛔蟲卵等。測試方法主要采用蛔蟲特異性引物，必須將測試反應條件進行統一化，在相同條件下開展PCR擴增，目的在于測試是否存在交叉反應等情況。

3.2.5靈敏性試驗

最終進行靈敏性測驗，利用顯微鏡進行精度觀察，對人蛔蟲、牲畜類蛔蟲與相關蟲卵進行計數，同時進行DNA分別獲取，并采用PCR檢測。

3.3實驗結果與討論

3.3.1 PCR檢測結果

在PCR擴增完成后，對禽類蛔蟲卵、牲畜蛔蟲卵和人蛔蟲卵的PCR產物分別進行15g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過檢測可發現，在980、1050和1070bp處，均發現清晰的條帶，這證明引物的特異性較好，且PCR擴增條件符合要求。

3.3.2特異性檢測

通過本次實驗所建立的PCR方法，能夠有效檢測出禽類蛔蟲卵、牲畜蛔蟲卵、人蛔蟲卵的DNA，而旋毛蟲、囊尾蚴、鞭蟲、旋毛蟲、囊尾蚴、鉤蟲、弓形蟲、毛圓線蟲等的DNA以及蒸餾水的空白對照組均未出現特異性擴增現象，這說明，本次實驗所建立的PCR方法對食品內蛔蟲卵的檢測具有特異性，該方法可用于后續的檢測工作。

3.3.3靈敏度檢測結果

顯微鏡下計數人蛔蟲卵和豬蛔蟲卵，抽提DNA，以特異性引物進行PCR檢測靈敏度試驗。結果表明，只要存在一個人蛔蟲卵DNA即可擴增出特異性條帶，表明用本方法靈敏度較高。

3.4對試驗結果的討論

為克服傳統的病原學檢測的方法的不足，在本次實驗中，建立了一種新的檢測方法，主要根據蛔蟲核糖體DNA上介于19S和29S之間的內轉錄間隔區ITS1基因在不同種間的序列差異，通過設計特異性強的引物，直接檢測蛔蟲的基因，該方法有著更高的可靠性和準確度。

結束語：綜上所述，通過對關于如何利用PCR方法檢測食品內蛔蟲卵進行分析，并結合實際情況及發展需求，對食品內蛔蟲卵利用PCR檢測方法的可行性進行提出。從未來我國食品安全角度出發，對PCR檢測方法的進一步應用進行剖析，為下一步工作開展奠定堅實基礎。

參考文獻

[1]古麗米娜.實時熒光定量PCR在食品致病菌檢測中的應用[J].臨床檢驗雜志（電子版），2020（002）：246.

[2]許銀葉，蘇少霖，許佩勤，等.實時熒光PCR法測定嬰幼兒輔助食品中過敏原魚類成分[J].食品安全質量檢測學報，2020，11（08）：141-145.

[3]冀國強，李穎，張爽，等.一起產氣莢膜梭菌食物中毒事件的實驗室檢測分析[J].疾病監測，2020，35（6）：547-551.

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