辣椒炭疽病菌效應因子NIS1-PCR-RFLP標記系統的建立

歐陽超，劉思珍，滿益龍，盛家偉，陳岳，張鑫，劉勇，張德詠，譚新球

摘要：【目的】基于辣椒炭疽病菌種群復雜、田間復合侵染種群組成不清，導致防控相對困難的問題，建立一種快速直觀的辣椒炭疽病菌區分標記系統，為其病害田間防控提供科學依據?！痉椒ā坷胷DNA-ITS通用引物克隆田間分離的22株辣椒炭疽病菌rDNA-ITS，通過其序列比對分析構建系統發育進化樹，初步確定22株供試菌株的種類和分類地位;選用效應因子NIS1基因為靶標，根據辣椒膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和黃瓜炭疽菌（C. orbiculare）NIS1基因比對分析，設計NIS1基因簡并引物，克隆22株辣椒炭疽病菌的NIS1基因，利用其序列比對分析構建系統發育進化樹，分析比較rDNA-ITS和NIS1基因區分供試菌株的差異，進而對22株不同辣椒炭疽病菌NIS1基因進行分析，選擇限制性內切酶，分析NIS1基因的PCR產物限制性片段多態性（RFLP）差異，建立NIS1-PCR-RFLP標記系統?！窘Y果】rDNA-ITS序列系統進化分析表明22株辣椒炭疽病菌屬于5種炭疽病菌，即膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、短孢炭疽菌（C. brevisporum）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）、平頭炭疽菌（C. truncatum）和黑點炭疽菌（C. capsici），其序列同源性為85.6%～99.8%，但C. capsici和C. truncatum處于同一混合組群;22株辣椒炭疽病菌的NIS1基因兩端序列較保守，中間存在可變區，與已報道的C. orbiculare的NIS1基因同源性在34.6%～78.9%;NIS1基因系統發育進化樹能將22株辣椒炭疽病菌分成5個組群，C. capsici和C. truncatum處于不同組群，表明其區分度優于rDNA-ITS;NIS1-PCR- RFLP主要差異片段顯示C. gloeosporioides和C. brevisporum的最大片段均為210 bp，但片段數目不同，而C. acutatum為292 bp，C. capsici為685 bp，C. truncatum為345 bp，參照菌株C. orbiculare為497 bp，能夠直觀觀察區分?！窘Y論】研究建立的NIS1-PCR-RFLP標記系統可簡便、直觀地區分不同辣椒炭疽病菌的差異，有望發展成為真菌新的分子標記應用于田間辣椒炭疽病菌種群的快速鑒定。

關鍵詞： 辣椒炭疽病菌;效應因子NIS1;PCR-RFLP;標記系統;核糖體DNA轉錄間隔區（rDNA-ITS）

中圖分類號： S436.418.11? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）09-2473-09

Development of NIS1-PCR-RFLP marker system to effectors of Colletotrichum spp. from infected pepper plants

OUYANG Chao1，2， LIU Si-zhen1，2， MAN Yi-long3， SHENG Jia-wei2，4， CHEN Yue2，

ZHANG Xin2， LIU Yong1，2， ZHANG De-yong1，2， TAN Xin-qiu1，2*

（1Long Ping Branch，Graduate School of Hunan University， Changsha? 410125， China; 2Plant Protection Institute，Hunan Academy of Agricultural Sciences，Changsha? 410125， China; 3Biotechnology Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha? 410125， China; 4Agricultural University of Hunan， Changsha? 410000， China）

Abstract：【Objective】Based on the complex population of pepper anthracnose and unclear composition of compound infection population in the fields， it was relatively difficult to control capsicum anthracis. Therefore， a rapid and intuitive marking system for pepper anthracnose was established to provide scientific basis for field control of the disease. 【Me-thod】The rDNA-ITS primers were used to clone 22 isolates of pepper Colletotrichum spp. isolated from field. The phylogenetic tree was constructed by sequence alignment analysis， and the species and taxonomic status of 22 isolates were preliminarily determined. An effector NIS1 gene as target， its alignment was performed between Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum orbiculare to design degenerate primers of NIS1 by genome database. NIS1 gene was isolated and cloned of 22 different strains of pepper Colletotrichum spp.， and phylogenetic tree of NIS1 gene was constructed with their NIS1 sequences alignment. Analyzed and compared the genes of rDNA-ITS and NIS1 gene to distinguish the diffe-rence of the tested strains， and then analyzed the NIS1 gene of 22 different strains of pepper Colletotrichum spp.， selected restriction endonuclease， analyzed the difference of PCR product restriction fragment length polymorphism （RFLP） of NIS1 gene， and established the NIS1-PCR-RFLP labeling system. 【Result】Phylogenetic analysis of rDNA-ITS sequences showed that 22 strains of Colletotrichum spp. belonged to 5 species of C. gloeosporioides， C. brevisporum， C. acutatum， C. truncatum and C. capsici， and their sequences homology was 85.6%-99.8%， but C. capsici and C. truncatum were in the same mixed group. The NIS1 gene sequences of 22 strains of Colletotrichum spp. were conserved， and there was varia-ble region in the middle， which was 34.6%-78.9% homologous with the NIS1 gene of C. orbiculare. The NIS1 gene phylogenetic tree could divide 22 strains of Colletotrichum spp. into 5 groups， and C. capsici and C. truncatum were in diffe-rent groups， indicating that their differentiation was better than rDNA-ITS. NIS1-PCR-RFLP showed that the maximum fragments of C. gloeosporioides and C. brevisporum were both 210 bp， but the number of fragments was different， while those of C. acutatum， C. capsici and C. truncatum were 292， 685， and 345 bp， respectively. The reference strain C. orbiculare was 497 bp， which can be visually distinguished. 【Conclusion】The NIS1-PCR-RFLP marking system was established in this study， it can easily and directly distinguish the differences of different Colletotrichum spp. infected pepper plants， Therefore， the NIS1-PCR-RFLP marking system is expected to be developed into a new fungal molecular marker for rapid identification of Colletotrichum spp. from infected pepper plants in field.

Key words： pepper Colletotrichum spp.; effector NIS1; PCR-RFLP;marker system; rDNA internal transcribed spacers （rDNA-ITS）

Foundation item： General Project of National Natural Science Foundation of China（31972223）; Youth Fund of National Natural Science of China（31701814）; Hunan Agriculture Science and Technology Innovation Fund Project（2020CX39， 2020CX43）

0 引言

【研究意義】辣椒炭疽病是辣椒生產過程中的重要真菌病害之一，其種類多、寄主范圍廣、危害重，且傳播速度快（Mongkolpn and Taylo，2018;Toporek and Keinath，2020;Naveen et al.，2021）。目前我國已報道的辣椒炭疽病菌種群主要包括膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）、平頭炭疽菌（C. truncatum）、黑點炭疽菌（C. capsici）和短孢炭疽菌（C. brevisporum）5種，嚴重威脅辣椒生產（Diao et al.，2017;魏立娟，2019）。田間采樣檢測證實辣椒炭疽病菌主要以復合侵染為主，復合侵染率高達30%～50%，這可能是田間防治困難的重要原因之一（Ren et al.，2020）。不同辣椒炭疽病菌對化學藥劑的敏感性存在巨大差異，滿益龍等（2016）研究發現不同炭疽病菌對化學農藥唑菌酯的敏感性最高相差300倍，推測是田間化學防控效率低的重要原因。辣椒炭疽病菌遺傳復雜多樣，曾泉（2019）研究表明不同來源的膠孢炭疽菌種群內存在明顯的遺傳多樣性，且不同地區的優勢種群內存在明顯遺傳差異;此外，菌株本身的形態學特征和致病性等也存在類似現象;霍建飛等（2020a）、周建波等（2020）研究也證實辣椒炭疽病菌遺傳變異與地理結構和寄主植物存在一定的相關性。因此，尋求一種快速、有效區分不同種類炭疽病菌的方法，是實現田間早期辣椒炭疽病精準防治的重要基礎?！厩叭搜芯窟M展】植物病原真菌的分子標記多樣，研究人員根據研究對象和基因組數據，采用不同分子標記使相同的供試菌株遺傳多樣性展現得更清楚。真菌不同分子標記系統具有自身的特點，但目前為止尚無完全統一的模式，基本上根據研究需要在現有基礎上發展或綜合不同的標記體系。相比較而言，國內外構建的炭疽菌（Colletotrichum spp.）系統鑒定常用的分子標記系統中，rDNA-ITS因具有序列片段小、高拷貝數等特點在炭疽菌的鑒定和系統發育研究中占據重要位置，如利用rDNA-ITS對紫山藥炭疽病菌（韓曉勇等，2020）、辣椒炭疽病菌（霍建飛等，2020b）、山竹炭疽病菌（楊冬平等，2020）、油茶炭疽病菌（尹華慶等，2020）和大豆炭疽病菌（畢秋艷等，2021）等進行鑒定和分類研究，但研究表明利用rDNA-ITS序列不能有效區分近緣種，如C. capsici和C. truncatum（曾大興，2004;滿益龍等，2016）。為此，研究人員開發了甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）、交配型基因（MAT1-2-1）、肌動蛋白基因（ACT）、DNA裂解酶基因（APN2）、GAPDH與假設蛋白基因間間隔區（GAP 2-IGS）、鈣調素基因（CAL）、幾丁質合成酶A基因（CHS-1）、谷氨酰胺合成酶基因（GS）、組蛋白基因（HIS3）、超氧化物歧化酶基因SOD2和β-微管蛋白基因TUB2（韓長志，2015;Villafana et al.，2019）等多基因復合標記系統，如劉威等（2017）采用形態學結合基于GS、TUB2和rDNA-ITS等基因序列聯合分析茶樹炭疽病原菌;Diao等（2017）利用ITS、ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、TUB2和HIS3多基因序列聯合分析全國29個?。▍^、直轄市）的典型辣椒炭疽病菌;王妮等（2019）采用ITS、ACT、TUB2、CHS1和GAPDH多基因序列聯合分析辣椒炭疽病病原菌;王雪菲等（2020）采用CAL和GS多基因序列分析核桃炭疽病病原菌。雖然多基因聯合分析可為一些炭疽病菌復合種群的分類鑒定提供最佳標記，但在實際應用中，其程序復雜、耗時長等缺點導致無法廣泛應用，且目前沒有能對所有炭疽菌種進行有效區分的標記。Willie等（2020）利用系統發育信息分析、系譜分類指數（GSI）和貝葉斯一致性分析（BCA）結合評估了13種分子標記技術在炭疽菌屬系統發育中的應用，發現GAPDH、HIS3和TUB2聯合區分炭疽病菌種類具有較明顯的優勢，但該組合對C. gloeosporioides等種群內遺傳多樣性區分不具備明顯優勢，繼而發展了DNA裂解酶基因與交配型基因間間隔區（APN2/MAT-IGS）標記系統。遺憾的是，目前尚未能構建出針對性強、簡單直觀的分類標記系統應用于辣椒炭疽病菌種類區分。Yoshino等（2012）研究發現誘導壞死分泌蛋白基因（Necrosis-inducing secreted protein 1，NIS1）作為一個相對保守的效應因子，在黃瓜炭疽病菌（C. orbiculare）中以單拷貝的形式存在，其編碼的蛋白可誘導本氏煙煙草細胞死亡。UniProt KB數據庫比對分析發現CoNIS1有219個假定的同源物，廣泛存在于子囊菌門和擔子菌門真菌中，表明NIS1效應因子廣泛存在且相對保守（Hiroki et al.，2019），特別是基因兩側相對保守，存在相對>100 bp的可變區，符合作為分子標記的基本特征。而且本課題組實驗室分析辣椒C. gloeosporioides-CSLL11基因組發現NIS1基因也是以單拷貝的形式存在，基因片段大小為500 bp左右，由1個內含子和2個外顯子組成;將不同辣椒炭疽病菌的NIS1基因進行比對，發現不同辣椒炭疽病菌的NIS1基因存在片段缺失或插入，表明也可能存在生物學功能分化，這可能是病菌在環境中與寄主協同進化的結果，與Hiroki等（2019）的研究結果一致，因此，推測NIS1基因可作為一種有效區分侵染辣椒的主要炭疽菌種類新的分子標記?！颈狙芯壳腥朦c】前人對辣椒炭疽病主要病原菌的分離鑒定和系統發育分析多采用rDNA-ITS及多基因聯合分析法，而且不同研究使用不同的分子標記系統，其遺傳多樣性存在一定差異。真菌功能基因一直是研究熱點，特別是真菌與寄主協同進化過程中，致病功能基因協同進化是真菌適應寄主植物的重要手段，而目前關于利用重要功能基因作為真菌種類鑒定的分子標記研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過克隆供試菌株的NIS1和rDNA-ITS，根據相關序列構建NIS1和rDNA-ITS系統發育進化樹，確定NIS1基因在不同種辣椒炭疽病菌系統發育進化中的區分度;比對分析不同辣椒炭疽病菌NIS1基因序列，結合PCR-RFLP分析，明確不同辣椒炭疽病菌NIS1基因的多態性差異，實現簡單、直觀、快速有效區分不同種辣椒炭疽病菌，為田間辣椒炭疽病菌種群的快速鑒定和高效防控提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株 供試菌株主要分離自湖南辣椒主產區具有典型炭疽病病癥的辣椒樣品。所有分離菌株結合各形態特征和分子標記rDNA-ITS序列比對分析，初步證實為膠孢炭疽菌、尖孢炭疽菌、短孢炭疽菌、黑點炭疽菌和平頭炭疽菌。另外選取1株黃瓜炭疽病菌（C. orbiculare）作為參照菌。所有供試菌株均已接種斜面4 ℃保存，具體信息見表1。

1. 1. 2 供試培養基 PDA固體培養基：馬鈴薯葡萄糖培養基（索萊寶Solarbio公司）46 g，H2O 1 L。 PDA液體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 L。LB培養基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，H2O 1 L，調pH 7.2;LB固體培養基：在液體培養基的基礎上每升加入15 g瓊脂。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 不同辣椒炭疽病菌菌株基因組DNA提取與純化 將斜面保存的菌株接種至PDA固體培養基中活化，28 ℃培養箱培養3 d，取直徑為0.5 cm大小的菌絲餅3～4塊于PDA液體培養基中28 ℃搖床培養3 d，雙層紗布過濾，無菌水漂洗2次，用濾紙吸除多余水分，液氮充分研磨，采用CTAB法提取其基因組DNA，并溶于適量的無菌ddH2O中，-20 ℃保存備用。

1. 2. 2 辣椒炭疽病菌rDNA-ITS片段與NIS1基因引物設計 rDNA-ITS序列引物采用通用引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'和ITS5：5'-GGAA GTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。根據已報道的C. orbiculare NIS1（AB669517.1）基因，利用NCBI數據庫進行比對分析，發現NIS1氨基酸序列相對保守，但DNA序列存在一定變異。結合辣椒膠孢炭疽菌的NIS1序列DNAMAN 5.0分析，依據C. orbiculare、C. acutatum和C. gloeosporioides NIS1上下游序列分析，根據兩端保守特性設計其特異性簡并引物，NIS1-F：5'-ATGCAGTTCCG（T）CG（A）CT（C）TCC A（C）T-3'，NIS1-R：5'-ACTGGCTGCC（G）GACGT AGT（G）TC（G）-3'。

1. 2. 3 ITS片段和NIS1基因的克隆 利用1.2.1的DNA為模板，1.2.2特異性引物進行梯度PCR（52～65 ℃，設置12個梯度）以確定最佳反應條件。PCR反應體系25.00 μL：包括10×Taq Buffer（含Mg2+） 2.50 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.00 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.25 μL，TaKaRa Taq DNA polymerase 0.25 μL，DNA模板1.00 μL（≤200 μg），ddH2O 18.75 μL;擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s，退火（rDNA-ITS 56 ℃，NIS1 58 ℃）30 s，72 ℃ 30 s，共進行30個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定最佳反應條件。利用優化的反應條件，采用TaKaRa DNA片段回收試劑盒純化回收PCR產物?；厥盏哪康腄NA片段連接T1載體25 ℃ 10 min，轉化DH5α感受態細胞，利用菌落PCR篩選轉化子，獲得的陽性轉化子送生工生物工程（武漢）股份有限公司測序。

1. 2. 4 基于NISI基因和rDNA-ITS片段系統的發育進化樹構建 根據生工生物工程（武漢）股份有限公司所測序列結果，將測序結果導入NCBI進行BLAST分析。用MEGA 7.0對供試辣椒炭疽病菌的NIS1基因和rDNA-ITS片段序列進行比對分析，校正后采用bootstrap test（1000次重復）構建系統發育進化樹，遺傳距離用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）進行計算。

1. 2. 5 NIS1基因的RFLP分析 根據NIS1基因測序結果，利用DNAMAN 5.0對目標基因NIS1進行限制性內切酶位點分析，篩選限制性內切酶。構建酶切體系20 μL：包括6 μL PCR純化產物，1 μL Eco31I限制性內切酶（NEB），1 μL SacI限制性內切酶（NEB），2 μL Cutsmart Buffer，10 μL無菌ddH2O;反應條件：37 ℃孵育1 h，電泳后拍照觀察結果。

2 結果與分析

2. 1 不同辣椒炭疽病菌的rDNA-ITS序列比對分析結果

根據供試炭疽病菌的rDNA-ITS序列聚類分析結果（圖1），發現22株辣椒炭疽病菌可分為C. gloeosporioides（12株）、C. brevisporum（1株）、C. acutatum（4株）、C. truncatum和C. capsici混合（5株）4個組群。不同組群內部的同源性高達99.0%，未呈現明顯的地理分布特性;不同組群間，除了C. truncatum和C. capsici混合群外，相同種群基本聚集在同一分支，其中以C. truncatum rDNA-ITS序列為參考，C. gloeosporioides、C. brevisporum、C. acutatum和C. capsici與其同源性分別為92.0%、85.6%、89.4%和99.8%。表明rDNA-ITS不能將C. capsici與C. truncatum有效區分。

2. 2 不同辣椒炭疽病菌NIS1基因序列比對分析結果

以C. orbiculare（TJ01;GenBank NO.：AB6695 17.1）為外群，構建22株供試辣椒炭疽病菌的NIS1基因系統發育進化樹。結果（圖2）顯示，22株辣椒炭疽病菌可分為5個組群，C. capsici和C. truncatum處于不同進化分支上，但未觀察到相同種群內呈現明顯的地理區域差異。其中C. gloeosporioides組群包含12株菌株;C. brevisporum組群包含1株菌株;C. acutatum組群包含4株菌株;C. truncatum組群包含3株菌株;C. capsici組群包含2株菌株。表明NIS1基因可作為辣椒炭疽病菌種群遺傳多樣性研究的重要分子標記。此外，供試菌株NIS1基因序列比對發現，C. gloeosporioides、C. brevisporum、C. acutatum、C. capsici和C. truncatum與參考菌株C. orbiculare的NIS1基因同源性分別為78.5%、78.9%、70.7%、43.7%和34.6%，且其兩端序列較保守，中間存在可變區。

2. 3 rDNA-ITS與NIS1基因序列對不同辣椒炭疽病菌的區分度比較結果

基于供試菌株rDNA-ITS與NIS1基因序列比較分析，相同種群內部序列的同源性較高。為此從供試菌株中選擇5種辣椒炭疽病菌為代表進行區分度比較，NIS1基因將5種炭疽病菌分在不同分支，而且C. capsici和C. truncatum能清楚區分（圖3-A）;而C. capsici和C. truncatum的rDNA-ITS系統發育進化處于同一分支，無法有效區分（圖3-B）。表明NIS1基因對不同辣椒炭疽病菌的區分度優于rDNA-ITS。

2. 4 不同辣椒炭疽病菌NIS1-PCR-RFLP分析結果

以C. orbiculare為參照菌株，對22株供試辣椒炭疽病菌NIS1基因序列分析發現限制性內切酶Eco31I和SacI為RFLP分析的理想位點，Eco31I和SacI處理NIS1 PCR產物，在1.5%瓊脂糖凝膠電泳明顯觀察到可分離出的最大片段C. gloeosporioides為210 bp，C. acutatum為292 bp，C. capsici為685 bp，C. brevisporum為210 bp，C. truncatum為345 bp，參照菌株C. orbiculare為497 bp。盡管C. gloeosporioide和C. brevisporum可分離的最大片段相同，但RFLP的片段數目分別為5個和6個小片段，較容易區分（圖4）。

3 討論

本研究發現NIS1基因能將5種辣椒炭疽病菌清楚區分，特別是C. truncatum與C. capsici處在不同分支，但rDNA-ITS不能將其區分，表明NIS1基因的區分度高于傳統單基因標記如GAPDH、GS、HIS3和TUB2標記（Ariana and Sephra，2012;肖軍，2020）;值得一提的是，NIS1基因對復合種群區分結果與Willie等（2020）發展的DNA裂解酶基因與交配型基因間間隔區（APN2/MAT-IGS）標記一致。NIS1基因作為真菌侵染過程中負責靶向植物寄主免疫激酶的功能基因，Hiroki等（2019）通過NISI基因序列比對發現不同辣椒炭疽病菌的NIS1基因存在片段缺失或插入，表明存在生物學功能分化，推測是病菌在環境中與寄主協同進化的結果。根據UniProt KB數據庫比對分析結果，NIS1基因在真菌中廣泛存在而且相對保守，表明NIS1基因可作為真菌種類分子標記的新靶標，其可變區反映了不同炭疽病菌與寄主植物協同進化的差異，本研究結果與Hiroki等（2019）的研究結果一致。

基于目前辣椒種植方式（設施栽培和露地栽培）交替，田間辣椒炭疽病發病越來越嚴重，而且國際上不斷有新的辣椒炭疽病菌報道（de Silva et al.，2019;Sheu et al.，2020;May et al.，2021），導致田間復合侵染變得更復雜。本研究中，對不同區域來源的相同種炭疽病菌進行NIS1基因序列比對分析，發現NISI基因高度保守，未體現出不同地理來源的遺傳多樣性差異，但對于不同炭疽病菌，區分度明顯優于rDNA-ITS，是否能作為廣泛的炭疽病菌種群間的分子標記，有待擴大樣本量進一步驗證。

曾大興等（2004）對C. truncatum和C. capsici的rDNA-ITS序列進行RFLP序列分析，結果顯示其酶切圖譜完全一致，支持兩者為同一菌種。Ariana和Sephr（2012）利用分子標記基因對來自木瓜和辣椒的C. gloeosporioides和C. truncatum進行ITS-PCR-RFLP分析，利用11種限制性內切酶對48株菌株能有效區分;其中AluI，HaeIII，PvuII，RsaI和Sau3A能有效區分來自木瓜的C. gloeosporioides和C. truncatum;AluI，ApaI，PvuII，RsaI和SmaI能有效區分來自辣椒的C. gloeosporioides和C. truncatum;PvuII，RsaI和Sau3A能有效區分來自木瓜的C.gloeosporioides，研究中使用多種限制性內切酶進行RFLP分析，主要是ITS高度保守而且種間序列差異較小。而本研究主要針對不同辣椒炭疽病菌的NIS1-RFLP分析，2種限制性內切酶Eco31I和SacI消化后的PCR產物差異片段數目和大小觀察清楚，簡便直觀體現了不同辣椒炭疽病菌之間的差異，便于辣椒生產中炭疽病不同病原菌短時間內快速有效區分，可滿足防控實際需要。但利用NIS1-RFLP對來自辣椒的相同種炭疽病菌進行分析，發現Eco31I和SacI消化后的PCR產物模式完全相同，與其NIS1基因序列分析結果完全一致，因此，針對辣椒C. gloeosporioides種內的遺傳多樣性，需要參照Ariana和Sephr（2012）的研究，選擇不同的限制性內切酶，進一步優化PCR-RFLP體系。另外，本研究比較了來自橡膠、草莓和辣椒的膠孢炭疽病菌NIS1基因序列，盡管不同來源膠孢炭疽病菌NIS1基因序列的同源性為96%以上，但系統發育進化樹上處于不同分支，表明NIS1基因也可作為膠孢炭疽菌種內遺傳多樣性的分子標記，但其RFLP體系需要選擇不同的限制性內切酶來構建。

隨著生物信息學的發展，病原真菌基因組數據越來越多，為真菌新的標記發展打下了基礎。特別是廣譜功能基因的研究，為其提供了相對詳實的數據，便于新的分子標記研究;傳統標記系統與新的標記系統融合，如NIS1基因標記與其他標記系統融合，為復合種群的區分提供更多的信息。值得期待的是，NIS1基因及其他致病功能基因是否可作為真菌種類鑒定的重要標記，需要對更多功能基因進行研究驗證，從不同角度豐富真菌分子標記系統，相關研究工作目前正在進行中。

4 結論

本研究以辣椒炭疽病菌效應因子NIS1基因為靶標，成功發展了一種NIS1-PCR-RFLP標記系統，可快速有效區分侵染辣椒的C. truncatum、C. capsici、C. brevisporum、C. gloeosporioides和C. acutatum，明顯優于rDNA-ITS標記系統。該方法具有特異性強，簡便直觀等特點，有望發展成為真菌新的分子標記應用于田間辣椒炭疽病菌種群的快速鑒定。

參考文獻：

畢秋艷，黨志紅，朱偉旗，高占林，韓秀英，趙建江，王文橋，路粉，吳杰. 2021. 河北省大豆主要病原真菌鑒定及防治藥劑篩選[J]. 中國農業科學，54（1）：71-85. [Bi Q Y，Dang Z H，Zhu W Q，Gao Z L，Han X Y，Zhao J J，Wang W Q，Lu F，Wu J. 2021. Identification of major pathogenic fungi of soybean in Hebei Province and screening of control fungicides[J]. Agricultural Sciences in China，54（1）：71-85.] doi：10.3864/j.issn.0578-1752.2021.01.006.

韓長志. 2015. 炭疽菌屬真菌分類研究現狀及發展趨勢[J]. 中國植保導刊，35（6）：24-30. [Han C Z. 2015. Research review on taxonomy of genus Colletotrichum and its development trend[J]. China Plant Protection，35（6）：24-30.] doi：10.3969/j.issn.1672-6820.2015.06.005.

韓曉勇，殷劍美，張培通，王立，郭文琦，李春宏. 2020. 紫山藥炭疽病病原菌鑒定[J]. 分子植物育種，18（15）： 5010-5019. [Han X Y，Yin J M，Zhang P T，Wang L，Guo W Q，Li C H. 2020. Pathogen identification of anthracnose on purple Dioscorea alata L. caused by Colletotrichum spp.[J]. Molecular Plant Breeding，18（15）：5010-5019.] doi：10.13271/j.mpb.018.005010.

霍建飛，姚玉榮，郝永娟，于金萍，劉春艷，王萬立. 2020a. 天津市寧河區辣椒炭疽病病原鑒定及防治藥劑篩選[J]. 北方園藝，9（3）：1-7. [Huo J F，Yao Y R，Hao Y J，Yu J P，Liu C Y，Wang W L. 2020a. Identification of pathogens and screening of control agents of chili anthrax in Ninghe District，Tianjin[J]. Northern Horticuture，9（3）：1-7.] doi： 10.11937/bfyy.20192149.

霍建飛，姚玉榮，任文來，郝永娟，王勇，王萬立. 2020b. 戊唑醇對2種辣椒炭疽菌的敏感性差異[J]. 安徽農業科學，48（8）： 151-152. [Huo J F，Yao Y R，Ren W L，Hao Y J，Wang Y，Wang W L. 2020b. The sensitivity difference of tebuconazole against Colletotrichum scovillei and Colletotrichum truncatum[J]. Journal of Anhui Agricultural Scien-ces，48（8）： 151-152.] doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020. 08.035.

劉威，袁丁，郭桂義，楊國一，葉乃興. 2017. 茶樹炭疽病病原鑒定[J]. 南方農業學報，48（3）： 448-453. [Liu W，Yuan D，Guo G Y，Yang G Y，Ye N X. 2017. Identification of anthracnose pathogen in tea plant[J]. Journal of Southern Agriculture，48（3）：448-453.] doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2017.03.011.

滿益龍，譚新球，司乃國，陳岳，張卓，劉勇，張德詠. 2016. 不同辣椒炭疽病菌對唑菌酯的敏感性差異[J]. 植物保護，42（5）： 171-176. [Man Y L，Tan X Q，Si N G，Chen Y，Zhang Z，Liu Y，Zhang D Y. 2016. Sensitivity differentiation of different Colletotrichun spp. strains causing anthracnose of Capsicum annuum L. plants to pyraoxystrobin[J]. Plant Protection，42（5）：171-176.] doi：10.3969/ j.issn.0529-1542.2016.05.030.

王妮，尹顯慧，彭麗娟，李榮玉，龍友華，吳小毛，樊榮，王坤英，李繼業. 2019. 辣椒炭疽病病原鑒定及其殺菌劑毒力測定[J]. 植物保護，45（4）： 216-223. [Wang N，Yin X H，Peng L J，Li R Y，Long Y H，Wu X M，Fan R，Wang K Y，Li J Y. 2019. Identification of the pathogen and toxi-city test of fungicides to capsicum anthracnose[J]. Plant Protection，45（4）：216-223.] doi：10.16688/j.zwbh.201 8341.

王雪菲，李金榮，盧東曉，陳孟，朱會營，李會平. 2020. 核桃炭疽病病原菌的分離鑒定[J]. 植物保護學報，47（5）：1161-1162. [Wang X F，Li J R，Lu D X，Chen M，Zhu H Y，Li H P. 2020. Isolation and identification of pathogen of walnut anthracnose[J]. Journal of Plant Pathology，47（5）：1161-1162.] doi：10.13802/j.cnki.zwbhxb.2020.2019182.

魏立娟. 2019. 辣椒炭疽病菌的鑒定、綜合防治及互作后辣椒基因差異表達[D]. 蘭州：甘肅農業大學. [Wei L J. 2019. Identification，integrated control of Colletotrichum scovillei and differentially expressed genes in pepper after interaction between Colletotrichum scovillei and pe-pper[D]. Lanzhou： Gansu Agricultural University.] doi： 10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000088.

肖軍. 2020. 分子標記在植物分子系統學中的應用[J]. 生物學教學，45（11）： 4-6. [Xiao J. 2020. Application of molecular markers in plant molecular systems[J]. Biology Teaching，45（11）：4-6.] doi： 10.3969/j.issn.1004-7549. 2020.11.002.

楊冬平，胡加誼，陳兵. 2020. 海南省2種山竹真菌病害的分離與鑒定[J]. 中國熱帶農業，（5）：83-93. [Yang D P，Hu J Y，Chen B. 2020. Isolation and identification of two fungal diseases of mangosteen in Hainan[J]. Plant Protection，（5）：83-92.] doi： 10.3969/j.issn.1673-0658.2020.05. 020.

尹華慶，王建田，劉敏. 2020. 油茶炭疽病病原菌鑒定及防治藥劑篩選[J]. 湖南農業科學，（6）：70-72. [Yin H Q，Wang J T，Liu M. 2020. Pathogen identification of Camellia oleifera anthracnose and fungicides screening[J]. Hunan Agricultural Sciences，（6）：70-72.] doi：10.16498/j.cnki.hnnykx.2020.006.017.

曾大興，戚佩坤，姜子德. 2004. 孢類炭疽菌rDNA ITS區的RFLP分析及分類研究[J]. 植物病理學報，34（5）：431-436. [Zeng D X，Qi P K，Jiang Z D. 2004. RFLP analysis of ITS region of rDNA in the falcate-spored species of Colletotrichum[J]. Acta Phytopathologica Sinica，34（5）：431-436.] doi：10.3321/j.issn：0412-0914.2004.05. 008.

曾泉. 2019. 辣椒膠孢炭疽菌對抑霉唑及其衍生物的敏感性差異[D]. 長沙： 湖南大學. [Zeng Q. 2019. Sensitivity differentiation of Colletotrichum gloeosporioides causing pepper anthracnose to chemical imazalil and its derivations[D]. Changsha： Hunan University.] doi：10.27135/d.cnki.ghudu.2019.001568.

周建波，殷輝，呂紅，秦楠，趙曉軍. 2020. 8種不同類型藥劑對辣椒炭疽病的田間防治效果[J]. 中國瓜菜，33（11）： 72-76. [Zhou J B，Yin H，Lü H，Qin N，Zhao X J. 2020. Evaluation of field control effects of eight different types of fungicides on pepper anthracnose[J]. Chinese Melon Dishes，33（11）： 72-76.] doi：10.3969/j.issn.1673-2871. 2020.11.016.

Ariana M，Sephra N R. 2012. Genetic differentiation of Colletotrichum gloeosporioides and C. truncatum associated with anthracnose disease of papaya（Carica papaya L.） and bell pepper（Capsium annuum L.） based on ITS PCR-RFLP fingerprinting[J]. Molecular Biotechnology，50（3）： 237-249. doi：10.1007/s12033-011-9434-2.

de Silva D D，Groenewald J Z，Crous P W，Ades P K，Nasruddin A，Mongkolporn O，Taylor P W J. 2019. Identification，prevalence and pathogenicity of Colletotrichum species causing anthracnose of Capsicum annuum in Asia[J]. IMA Fungus，10（1）：8. doi：10.1186/s43008-019-0001-y.

Diao Y Z，Zhang C，Liu F，Wang W Z，Liu L，Cai L，Liu X L. 2017. Colletotrichum species causing anthracnose disease of chili in China[J]. Persoonia，38： 20-37. doi：10.3767/003158517X692788.

Hiroki I，Yoshihiro I，Masashi M，Kohji Y，Yuu O，Hiromasa S，Aiko U，Ryohei T，Saeko K，Ayumi K，Suthitar S O，Yoshitaka T. 2019. Conserved fungal effector suppresses PAMP-triggered immunity by targeting plant immune kinases[J]. PNAS，25： 496-505. doi：10.1073/pnas.180729 7116.

May M O，Kim M R，Kim D G，Kwak T S，Oh S K. 2021. First report of Colletotrichum siamense causing anthracnose of chili pepper fruit in Korea[J]. Plant Disease，105（5）：1567. doi： 10.1094/PDIS-10-20-2297-PDN.

Mongkolpn O，Taylo P W J. 2018. Chili anthracnose： Colletotrichum taxonomy and pathogenicity[J]. Plant Pathology，67（6）： 1255-1263. doi：10.1111/ppa.12850.

Naveen J，Navya H M，Hithamani G，Hariprasad P，Niranjana S R. 2021. Pathological，biochemical and molecular varia-bility of Colletotrichum truncatum incitant of anthracnose disease in chilli（Capsicum annuum L.）[J]. Microbial Pathogenesis，152：104611. doi： 10.1016/2020/104611.

Ren L，Wang S F，Shi X J，Shi X J， Cao J Y，Zhou J B，Zhao X J. 2020. Characterisation of sensitivity of Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum capsici，cau-sing pepper anthracnose，to picoxystrobin[J]. Journal of Plant Diseases and Protection，127：657-666. doi：10.1007/s41348-020-00316-y.

Sheu Z M，Chiu M H，Chang R J，Kenyon L. 2020. First report of Colletotrichum coccodes causing fruit anthracnose and leaf spot on sweet pepper in Taiwan[J]. New Disea-se Reports，42（1）：9. doi：10.5197/j.2044-0588.2020.042. 009.

Toporek S M，Keinath A P. 2020. First report of Colletotrichum scovillei causing anthracnose fruit rot on pepper in South Carolina，United States[J]. Plant Disease，105（4）：1222. doi： 10.1094/PDIS-08-20-1656-PDN.

Villafana R T，Ramdass A C，Rampersad S N. 2019. Colleto-trichum brevisporum is associated with anthracnose of red bell pepper fruit in Trinidad[J]. New Disease Reports，39（1）： 11. doi：10.5197/J.2044-0588.2019.039.011.

Willie A S V，Priscila A B，Anthony C S，Josiene S V，Marcos P S C，Vinson P D. 2020. Optimal markers for the identification of Colletotrichum species[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，143： 106694. doi：10.1016/j.ympev. 2019.106694.

Yoshino K，Irieda H，Sugimoto F，Yoshioka H，Okuno T，Takano Y. 2012. Cell death of Nicotiana benthamiana is induced by secreted protein NIS1 of Colletotrichum orbiculare and is suppressed by a homologue of CgDN3[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，25（5）：625-636. doi：10.1094/MPMI-12-11-0316.

（責任編輯 麻小燕）