馴化對長焰煤制生物氣過程氫化酶活性的響應分析*

黃 松 夏大平， 閆夏彤 劉春蘭 孫長彥 郭紅玉，3

(1.河南理工大學能源科學與工程學院，454000 河南焦作；2.河南理工大學資源環境學院，454000河南焦作；3.中原經濟區煤層(頁巖)氣河南省協同創新中心，454000 河南焦作)

0 引 言

煤炭開采勢必會對水資源、大氣及土壤等環境造成不利影響，如何清潔高效地利用煤炭資源，減輕環境負擔已成為當今煤炭轉型考慮的重中之重。煤制生物氣技術是在微生物的作用下，將煤定向轉化為氫氣、甲烷等有利物質的一種新技術，具有反應條件溫和、耗能少等優點，必將成為未來煤炭資源清潔高效開采的有效途徑之一[1-2]，而這種技術的首要環節便是高效菌源的獲取。目前，眾多學者已經在菌源選擇上做了許多先導性的工作。在不同地區、不同煤階的新鮮煤樣中均檢測有產氫產甲烷菌群[3-4]，另外，對煤層水的群落結構研究中也發現存在互營揮發性脂肪酸代謝產甲烷菌系[5]。對比不同煤階煤分別在本源菌和外源(如沼液、活性污泥和底泥等)菌作用下產氣效率的差異，發現外源菌的整體產氣效果要優于本源菌的整體產氣效果，而馴化是獲取高效菌更為關鍵的因素，微生物經過逐步馴化可縮減對煤的適應過程，使不同菌源菌群的產氣效率均得到提高[6-8]，這為后續增產研究提供了思路。通過將馴化后的外源菌群注入到煤層氣產量低、本源微生物活性弱的淺埋煤層，外源菌協同煤層本源菌共同促進煤層生物氣的產出。

氫化酶是一類存在于微生物體內的重要的生物酶，它能夠催化伴有氫分子吸收與釋放的氧化還原反應[9-11]，并且通過調控微生物體內氫氣的代謝來調節其他生理代謝活動[12]。氫化酶直接參與了產氫菌及產甲烷菌的物質代謝和能量代謝，在煤制生物氣過程中擔當著重要的角色[13-14]。通過測定H2產率，氫化酶活性可用于評價不同厭氧接種物的H2生成潛力[15]。有學者[14]在煤制生物氣過程中添加鐵鎳離子來探討氫化酶活性的變化，發現氫化酶活性隨離子濃度的增加呈現先增后減的變化趨勢，在產氣達到穩定時氫化酶活性也出現峰值，但由于菌群并未馴化，即便是添加最佳離子組合的鐵鎳離子，其活性峰值也僅為0.6 mL/(mg·min)[14]。氫化酶活性較低嚴重制約了菌群的表達活性，進而不利于生物氣的產出，因此，提高菌的氫化酶活性對于增產生物氣具有極大的現實意義。

隨著煤化程度的提高，煤分子中易被降解的側鏈官能團發生脫落，使芳構化程度不斷提高[16]，煤樣的發酵產氣能力與煤的降解率逐步下降[17]，所以低階煤是作為生物產氣底物的最佳選擇。而長焰煤屬于變質程度最低的煙煤，因其揮發分含量高且富含微生物生長所必需的一些微量元素，逐漸受到研究人員的青睞。鑒于此，本研究選擇以河南義馬千秋礦長焰煤為底物，分別選用礦井水、沼液和污泥作為菌源，逐代馴化培養產氫菌和產甲烷菌，并針對目前氫化酶活性的測定方法普遍存在的檢測靈敏度低、安全性差等問題[18]優化氫化酶活性的檢測方法，區分產氫菌與產甲烷菌氫化酶活性的測試差異，以有助于后續驗證馴化對氫化酶活性的影響；理清氫化酶活性與產氣量和菌濁的響應機制，以期為進一步進行氫化酶的分離純化和酶學性質的研究提供活性酶體的參考，從而為從酶學水平上調控煤厭氧發酵產生物氣提供依據。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

為盡量減少煤樣運輸過程中存在的氧化、有機質損耗等潛在問題，按照就近取樣原則對河南省義馬千秋礦長焰煤進行采樣。樣品采集后用清水洗滌，實驗前將煤樣用粉碎機粉碎至粒徑為0.10 mm～0.15 mm，高壓滅菌后于樣品袋中密封保存備用，煤樣的基本物性參數見表1。實驗所用菌源分別為煤礦礦井水、農家沼氣池中的沼液及污水處理廠排泄池中的厭氧污泥。為盡量保證厭氧條件，采集后要迅速密封，并及時送回實驗室置于4 ℃冰箱低溫冷藏保存，以保證菌種活性。

表1 煤樣的工業分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analyses of coal sample

1.2 實驗設計

1.2.1 不同菌源菌群的富集培養

分別配制產氫培養基及產甲烷培養基對采集到的不同菌源菌群進行富集培養，培養基及微量元素液的配方如下。

1) 產氫培養基(g/L)：1 L蒸餾水中分別加1.0 g NH4Cl，0.4 g K2HPO4·3H2O，2.0 g NaCl，2.0 g NaHCO3，0.1 g MgCl2·6H2O，1.0 g胰化酪蛋白，1.0 g酵母膏，10 g葡萄糖，0.5 g L-半胱氨酸鹽酸鹽，2.0 gEDTA二鈉，10 mL微量元素液。

2) 產甲烷培養基(g/L)：1 L蒸餾水中分別加1.0 g NH4Cl，0.1 g MgCl2·6H2O，0.4 g K2HPO4·3H2O，0.2 g KH2PO4，0.1 g胰化酪蛋白，0.1 g酵母膏，2.0 g乙酸鈉，2.0 g甲酸鈉，0.5 g L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.2 g Na2S·9H2O，2.0 g NaHCO3，0.001 g NaHCO3，10 mL微量元素液。

3) 微量元素液(g/L)：1 L蒸餾水中分別加1.5 g氮三乙酸，0.1 g CaCl2，3.0 g MgSO4·7H2O，0.05 g H3BO3，0.1 g FeSO4，1.0 g NaCl，0.1 g CoCl2，0.5 g MnSO4，0.1 g ZnSO4，0.05 g NaMoO4，0.01 g AlK(SO4)2，0.1 g NiCl2，0.01 g CuSO4。

1.2.2 氫化酶活性的測定

分別對三種來源的產氫菌和產甲烷菌的氫化酶活性進行測定分析。用A1和B1分別代表礦井水中的產氫菌和產甲烷菌，A2和B2分別代表沼液中的產氫菌和產甲烷菌，A3和B3分別代表污泥中的產氫菌和產甲烷菌；用A11，A21，A31，B11，B21，B31分別代表分別添加0.1 mL溶菌酶的礦井水、沼液和污泥中的產氫菌和產甲烷菌；用A12，A22，A32，B12，B22，B32分別代表各添加0.1 mL蒸餾水的礦井水、沼液和污泥中的產氫菌和產甲烷菌。將滅完菌的25 mL厭氧管放入厭氧工作站中30 min后，分別注入1 mL待測菌液，加入0.1 mL溶菌酶溶液或蒸餾水，向厭氧管中充N210 min后蓋上橡皮塞密封。預處理后將厭氧管置于40 ℃恒溫水浴鍋中，恒溫培養時間均為60 min，酶促反應10 min后添加0.2 mL 10%的三氯乙酸使反應終止，隨后及時抽取厭氧管中的氣體進行氣相色譜分析。

在保證菌源不變的情況下，分別選用甲基紫精和甘氨酸為氫化酶活性測定時的電子載體，考察不同電子載體對氫化酶活性測定的影響。

采用灼燒減重法對待測菌液中揮發性懸浮固體(mixed liquor volatile suspended solids，MLVSS)的質量進行測算，精度為0.01 mg。

氫化酶活性(HPE)的計算公式為：

(1)

式中：φ為酶促反應產生的氫氣的體積分數，%；V為厭氧管中的氣體體積，mL；mMLVSS為每1 mL待測菌液中揮發性懸浮固體的質量，mg；t為酶促反應進行的時間，min。

利用優化后的氫化酶活性測定方法分別對不同馴化周期及不同培養時間下產氫菌和產甲烷菌的氫化酶活性進行測試。

1.2.3 不同菌源菌群的馴化

環境溫度是影響高效菌馴化的重要因素，一般產氫菌的適宜溫度范圍為26 ℃～39 ℃，中溫產甲烷菌的適宜溫度范圍為30 ℃～45 ℃，而相關文獻[19-20]對于溫度條件的優選，普遍認為35 ℃是煤制生物氫、甲烷中菌群生長的適宜溫度，因此，選擇35 ℃作為本次馴化的最佳環境溫度。

產氫菌的一次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無葡萄糖的產氫培養基、2 mL接種后的菌液和0.2 g煤樣，在35 ℃環境下馴化培養4 d。二次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無葡萄糖的產氫培養基、2 mL一次馴化后的發酵菌液和0.4 g煤樣，繼續在35 ℃環境下馴化培養4 d。三次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無葡萄糖的產氫培養基、2 mL二次馴化后的發酵菌液和0.6 g煤樣，繼續在35 ℃環境下馴化培養4 d。

產甲烷菌的一次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無乙酸鈉和甲酸鈉的產甲烷培養基、2 mL接種后的菌液和0.2 g煤樣，在35 ℃環境下馴化培養4 d。二次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無乙酸鈉和甲酸鈉的產甲烷培養基、2 mL一次馴化后的發酵菌液和0.4 g煤樣，繼續在35 ℃環境下馴化培養4 d。三次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無乙酸鈉和甲酸鈉的產甲烷培養基、2 mL二次馴化后的菌液和0.6 g煤樣，在35 ℃環境下馴化培養4 d。

1.2.4 馴化后產氣量及生物活性的測定

采用GC-4000A型氣相色譜儀(北京東西分析儀器有限公司)測定氣體產物的組分和含量。首先使用外標法對氣相色譜進行標定，測試氣樣時依據其峰面積得到樣品中被測組分的體積分數(%)，通過總產氣量確定被測組分的體積(mL)，最后得出單位質量煤的產氣量(mL/g)。色譜條件：色譜柱采用填充柱，檢測器為TCD熱導檢測器，5A柱，進樣器溫度為50 ℃，檢測器溫度為100 ℃，熱絲溫度為120 ℃，載氣為高純氦氣，進樣量為1 mL。采用UV-5200型紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)測定不同產氫菌及產甲烷菌馴化階段在600 nm處的吸光值，用來表征細菌的生物活性。

2 結果與討論

2.1 氫化酶活性測定方法的優化

2.1.1 溶菌酶對氫化酶活性測定的影響

根據酶促反應中產生的氫氣量和菌液中揮發性懸浮固體(MLVSS)的質量，利用式(1)并統一以氣體總體積(V)為22.5 mL，酶促反應時間(t)為10 min對各來源產氫菌和產甲烷菌的氫化酶活性進行計算，結果如圖1所示。

圖1 溶菌酶對氫化酶活性測定的影響Fig.1 Influence of lysozyme on determination of hydrogenase activity

由圖1可以看出，溶菌酶對產氫菌氫化酶活性的測試有效果，而對產甲烷菌氫化酶活性的測試不起作用。這是由于溶菌酶主要破壞產氫菌菌體細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂，胞內氫化酶逸出[21]。而已有的研究[22-23]表明，產甲烷菌是典型的革蘭氏陰性菌，而革蘭氏陰性菌細胞壁所含的脂質比肽聚糖多，肽聚糖層很薄，除少量革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、普通變形菌和副溶血性弧菌等，溶菌酶對大多數的革蘭氏陰性菌都不起作用，因而在產甲烷過程氫化酶活性的預處理時，溶菌酶可以用等量的蒸餾水來代替。

2.1.2 電子載體對氫化酶活性測定的影響

不同電子載體對氫化酶活性測定的影響見圖2。由圖2可知，在以甘氨酸為電子載體時檢測出的產氫菌氫化酶活性均明顯高于以甲基紫精為電子載體時檢測出的產氫菌氫化酶活性。原因可能是甘氨酸作為電子載體，在預處理及恒溫處理過程中穩定性較甲基紫精穩定性高，一方面反應過程中甲基紫精易受到溫度的影響而發生部分分解；另一方面在操作過程中可能會有少量的氧氣混入厭氧管，而甲基紫精更容易被氧氣氧化，即使添加了還原劑，但在一定程度上仍會影響其發揮作用。

圖2 不同電子載體對氫化酶活性測定的影響Fig.2 Influence of different electron carriers on determination of hydrogenase activity

在以甘氨酸為電子載體時檢測出的礦井水中產甲烷菌氫化酶活性稍低于以甲基紫精為電子載體時檢測出的礦井水中產甲烷菌氫化酶活性，而對于沼液和污泥菌源產甲烷菌來講情況相反。原因可能是礦井水中產甲烷菌以鐵氧還蛋白為電子傳遞體的氫化酶催化反應稍微活躍，而甲基紫精的添加可以大大提高氫化酶催化放氫的速率[24]，所以在檢測礦井水中產甲烷菌的氫化酶活性時，甲基紫精的效果要稍微優于甘氨酸的效果。但總體而言，甘氨酸的作用效果要優于甲基紫精的作用效果。

2.2 不同菌源馴化培養菌群的氫化酶活性

根據上述實驗結果，現用優化后的氫化酶活性測定方法檢測馴化培養對不同菌源菌群的氫化酶活性的影響。

通過延長馴化周期和恒溫培養時間，發現二者的耦合效應可以最大程度上優選出氫化酶活性最佳的馴化條件，從而有利于后續產氫產甲烷的進行。圖3所示為逐代馴化培養對不同菌源菌群氫化酶活性的影響。由圖3可以看出，三種菌源菌群在未馴化就直接接種培養時，對煤表現出極大的不適應，隨著培養時間的延長，氫化酶活性逐漸增強，但始終保持在較低的水平。對菌群馴化能有效提高菌群對環境的適應能力，礦井水中的產氫菌在三次馴化并恒溫培養48 h后氫化酶活性最高，為0.11 mL/(mg·min)；產甲烷菌的氫化酶活性普遍高于產氫菌的氫化酶活性，其中，礦井水中的產甲烷菌在三次馴化并恒溫培養56 h后氫化酶活性達到最大值2.84 mL/(mg·min)；另外兩種菌源菌群均提前達到氫化酶活性最高值，其中沼液中產氫菌在二次馴化并恒溫培養48 h后氫化酶活性最大，為0.17 mL/(mg·min)，而沼液中產甲烷菌在二次馴化并恒溫培養64 h后氫化酶活性最大，為2.23 mL/(mg·min)；污泥中產氫菌在二次馴化并恒溫培養56 h后氫化酶活性最大，為0.14 mL/(mg·min)，而污泥中產甲烷菌在二次馴化并恒溫培養80 h后氫化酶活性最大，為2.45 mL/(mg·min)。

圖3 逐代馴化培養對不同菌源菌群氫化酶活性的影響Fig.3 Influence of successive generation acclimation and cultivation on hydrogenase activity of bacterium from different bacterial sourcesa—A1；b—A2；c—A3；d—B1；e—B2；f—B3

對以礦井水為菌源的產氫菌和產甲烷菌進行馴化，達到氫化酶活性峰值的延滯期都要比對其他兩種菌源產氫菌和產甲烷菌進行馴化達到氫化酶活性峰值的延滯期長，分析認為，礦井水為采自煤層的地下水，沼液是利用生物有機質厭氧發酵的液體，而污泥是由微生物群體及吸附的污水中有機和無機物質組成，由于其底物及水源的限制，礦井水中菌的數量和種類較少，所以總體而言，礦井水菌群的氫化酶活性要低于沼液菌群和污泥菌群的氫化酶活性[6]。在馴化時間較短時，細菌剛進入延滯期，還未達到生長對數期，而隨著馴化培養的進行，細菌的數量逐漸增多，代謝活性也逐漸增強，總的氫化酶活性增大；不同菌源菌群的氫化酶活性隨恒溫培養時間的延長基本表現出先增后減的趨勢，培養初期，煤表面官能團結構復雜，較難脫落，導致菌群對煤的降解不充分；隨著時間的延長，降解產生的氨氮及代謝毒素對菌群造成不利作用[25]，氫化酶活性也隨之降低。

在對菌源中的產氫菌和產甲烷菌進行氫化酶活性測定時分別添加了產甲烷菌抑制劑2-溴乙烷磺酸鈉和產氫菌抑制劑盤尼西林-G，從而在對產氫菌氫化酶活性進行測定時，由于產甲烷菌的活性受到抑制，無法利用已產生的氫氣，故厭氧管中的氫分壓難以降低，因此沒有更多的氫氣產生；而在對產甲烷菌氫化酶活性進行測定時，馴化培養階段菌液中產生的乙酸、丙酸、丁酸等發酵產生氫氣，進而在測定氫化酶活性時被產甲烷菌消耗使得氫分壓降低[26]，菌液中的小分子酸進而轉化產生氫氣，故產甲烷菌氫化酶活性的測定值遠高于產氫菌氫化酶活性的測定值。

2.3 產氣特征與氫化酶活性的關系

不同菌源菌群在逐代馴化培養時的氫化酶活性具有差異，而這種差異就直觀地表現在產氣特征上。圖4所示為逐代馴化培養后不同菌源菌群的產氣特征。

由圖4可以看出，礦井水無論作為產氫菌源還是產甲烷菌源，菌群的產氣量均隨著馴化代數的增加而增大，在三次馴化時均達到最大值，其中產氫量最大值為10.89 mL/g，產甲烷量最大值為6.54 mL/g。以沼液和污泥為菌源時，菌群的產氣特征與以礦井水為菌源時菌群的產氣特征相似，兩者無論是作為產氫菌源還是產甲烷菌源，菌群的產氣量都呈現出先增后減的變化趨勢，并且都在二次馴化時達到最大值，其中，沼液菌群的產氫量最大值為14.45 mL/g，產甲烷量最大值為4.95 mL/g；污泥菌群的產氫量最大值為11.32 mL/g，產甲烷量最大值為5.51 mL/g。

圖4 逐代馴化培養后不同菌源菌群的產氣特征Fig.4 Gas production characteristics of bacterium fromdifferent bacterial sources after successive generationacclimation and cultivation

不同菌源菌群的產氣效果與各自馴化階段表現出的氫化酶活性高度一致。在未馴化前，由于菌群還未適應以煤為底物的環境，導致初期氫化酶活性較弱，產氣量也較低。其中，由于沼液中可能存在可供微生物利用的生物有機質，導致在馴化前以沼液為菌源的菌群產氣量較大。對菌群的逐代馴化有效地提高了菌群對環境的適應能力，氫化酶活性逐漸增強，對應的產氣量也逐漸增大。沼液產氫菌在二次馴化時氫化酶活性最大，同時其產氫量也是三種菌源產氫菌產氣量中最大的。同理，礦井水中產甲烷菌在適應煤環境后，在三次馴化時氫化酶活性和產甲烷量同時達到最大值。

對比文獻[27]研究，煤制生物氫技術屬于暗發酵，與傳統的光解水制氫技術相比，其能量轉化效率更高。對比同樣以河南義馬千秋礦長焰煤為底物，以礦井水為菌源的產氫實驗，發現其最終累計產氫量為6.24 mL/g[28]，而本研究礦井水中產氫菌經馴化后的產氫量為10.89 mL/g，增產了74.52%，足以說明馴化菌群對于增產有極大的促進作用。而另一項研究[29]在優化煤制氫產出條件時，獲得的氫氣產量高達24.26 mL/g，原因在于添加了10 mL/g的FeCl2·4H2O，Fe是氫化酶的重要組成部分，Fe2+的添加通過促進氫化酶的合成來達到提高氫氣產量的目的。馴化本身是為了提高菌群對環境的適應性，其雖也增大氫化酶活性，但仍不及添加Fe2+的促進效果。同理，經馴化后的產甲烷菌的產氣能力相較于其他文獻[30]報道中產甲烷菌的產氣能力均有所提高。

2.4 菌濁與氫化酶活性的關系

以煤為唯一碳源的馴化培養能增強菌種對煤的適應性，逐步提升氫化酶活性，細菌培養液在600 nm處的吸光值D(600)可直接反映菌濁特征，并間接考察菌濁與氫化酶活性的關系。

三種來源產氫菌在不同馴化培養階段的D(600)值如圖5所示。由圖5可以看出，馴化前菌液的D(600)明顯高于馴化后菌液的D(600)，說明三種產氫菌液在馴化前的微生物總量高于馴化后的微生物總量，馴化前產氫菌液中可能存在大量的非產氫細菌，它們的存在會使得菌液的生物活性很大，但卻會干擾針對產氫菌的氫化酶活性測定，而在測定過程中，為了提高測定結果的準確性，雖添加了產甲烷菌活性抑制劑2-溴乙烷磺酸鈉，但其對大部分的非產甲烷雜菌并不起作用。馴化后菌液中原本存在的無法利用煤的細菌因缺乏碳源而大量死亡。隨著馴化的進行，產氫菌的相對含量不斷增加，加之恒溫培養時間的延長，使得產氫菌源的D(600)值不斷增大。

圖5 逐代馴化過程檢測的不同菌源的D(600)值Fig.5 D(600) values of different bacterial sources detected in the process of generational acclimation

將三種產甲烷菌源在不同培養階段的D(600)測算值進行對比后可以看出，產甲烷菌源的D(600)值在不同培養階段的變化規律與產氫菌源的D(600)值在不同培養階段的變化規律不同，產甲烷菌源在馴化前的D(600)值低于馴化后的D(600)值，說明接種后細菌的生長速度緩慢，這基本符合產甲烷菌的生長繁殖特性，產甲烷菌屬于典型的長生長周期的厭氧細菌[31-32]，接種后短短3 d的培養時間，產甲烷菌仍處于生長緩慢期，特別是礦井水菌源，因其中的細菌數量本就少于沼液和污泥中的細菌數量，故相應的D(600)值也小于沼液和污泥的D(600)值，這也是初期氫化酶活性較弱的原因。而隨著馴化的進行，產甲烷菌逐漸適應以煤為碳源進行生長和繁殖，數量不斷增多，之后D(600)出現下降，此時氫化酶活性也有所減弱。

3 結 論

1) 分別確定了產氫菌和產甲烷菌氫化酶活性的測定條件，產氫菌氫化酶活性的測定需加入溶菌酶，而產甲烷菌氫化酶活性的測定可以添加等量的水替代，并且以甘氨酸為電子載體測定氫化酶活性的作用效果要優于以甲基紫精為電子載體測定氫化酶活性的作用效果。

2) 不同菌源中，產甲烷菌經過逐代馴化培養的氫化酶活性遠高于產氫菌經過逐代馴化培養的氫化酶活性，產甲烷菌的氫化酶活性保持在2 mL/(mg·min)左右，而產氫菌的氫化酶活性基本維持在0.1 mL/(mg·min)這一很低的水平。主要是因為產甲烷菌的耗氫作用能夠有效降低環境中的氫分壓，有利于有機物分解產氫。

3) 不同菌源菌群的氫化酶活性隨馴化培養時間的延長基本表現出先增后減的趨勢，各菌源菌群馴化培養氫化酶活性達到峰值的條件分別為：A1經三次馴化并培養48 h，峰值為0.11 mL/(mg·min)；A2經二次馴化并培養48 h，峰值為0.17 mL/(mg·min)；A3經二次馴化并培養56 h，峰值為0.14 mL/(mg·min)；B1經三次馴化并培養56 h，峰值為2.84 mL/(mg·min)；B2經二次馴化并培養64 h，峰值為2.23 mL/(mg·min)；B3經二次馴化并培養80 h，峰值為2.45 mL/(mg·min)。

4) 不同菌源菌群的產氣效果和菌濁與各自馴化階段表現出的氫化酶活性高度一致。其中A1，A2和A3的氫氣產量峰值分別為10.89 mL/g，14.45 mL/g和11.32 mL/g，B1，B2和B3的甲烷產量峰值分別為6.54 mL/g，4.95 mL/g和5.51 mL/g。