煙草葉蛋白提取技術研究進展

李猛政 李榮華 夏巖石 郭培國

摘?要：煙草除了可以作為卷煙原料外，其葉蛋白也是世界上最豐富的蛋白質資源之一。煙葉中的蛋白質分為可溶性蛋白質和不溶性蛋白質，其中約一半的可溶性蛋白是FI蛋白（Fraction I protein），另一半是FII蛋白（Fraction II protein）。隨著科學的發展，許多新技術已應用于蛋白質分離，如雙水相萃取法、超濾法、層析法、電泳法等。本文根據國內外相關研究資料，對目前分離煙草葉蛋白常用的幾種提取技術及進展進行了綜述和討論，并展望了其應用前景。

關鍵詞：煙草;葉蛋白;提取技術;研究進展

Abstract： Tobacco is the raw material of cigarettes in general， but its leaf is one of the most abundant protein resources in the world. The proteins in tobacco leaves can be divided into water-soluble and water-insoluble proteins. Half of the soluble proteins are FI proteins （Fraction I proteins）， and the other half are FII proteins （Fraction II proteins）. With the development of technology， many new technologies have been applied to protein separation， such as aqueous two-phase extraction， ultrafiltration， chromatography， and electrophoresis. According to the relevant research literatures at home and abroad， several commonly used extraction techniques and the latest progress for separating tobacco leaf proteins were reviewed and discussed in this article， and their application prospects were described.

Keywords： tobacco; leaf protein; extraction technology; research progress

我國是煙草最主要的生產國和消費國之一，每年煙草的種植面積可達100萬hm2，生產煙葉約175萬t[1]。蛋白質是煙草眾多生物活性成分中含量最為豐富的一種，其在白肋煙中的含量高達20.48%[2]。隨著對蛋白質研究的不斷深入，人們逐漸認識到植物葉蛋白，尤其是煙草葉片中的蛋白質[3]，是世界天然產物中最重要且豐富的蛋白質資源。

從營養、醫療和食品角度來評價，煙草葉蛋白屬于優質蛋白[4]。煙草葉蛋白的氨基酸組成和含量相當豐富、均衡，所含的必需氨基酸與雞蛋、牛奶相接近，用它可以代替牛奶，可為因乳糖不耐受而不宜飲用牛奶的人提供另一種高營養食品蛋白源[5]。煙草葉蛋白中富含硒，以硒蛋氨酸和硒半胱氨酸或其他形式存在[6]，在清除自由基、防護紅細胞溶血、化學性肝損傷保護等方面都優于不含硒的蛋白質[7]。煙草葉蛋白經酶水解提取出的活性十三肽，具有抗菌活性和蛋白酶抑制活性[8-9]，且穩定性較高，是制備抗菌肽和降壓肽的重要潛在資源。另外，煙草作為最重要的植物生物反應器[10-12]，其葉片生物量大（約100 t/hm2）、葉片可溶性蛋白含量高、有完善的真核表達系統，可以為多種外源蛋白提供正確的翻譯后修飾（PTM），表達具有生物活性的外源重組蛋白，可以應用于人或動物的疾病治療及預防。

在煙草的種植和加工過程中會有大量的低次煙葉產生，這些低次煙葉往往蛋白質含量較高，會導致煙氣中有害物質增加，除少量用于生產煙膏和農藥外，大部分被拋棄，既浪費了大量寶貴的資源，又污染了環境。如果可以從低次煙葉中提取蛋白質，那么煙草的利用率和附加值將大大提高。本文根據國內外相關研究資料，對目前分離煙草葉蛋白常用的幾種提取技術及進展進行了綜述和討論，并展望了其應用前景。

煙草葉蛋白可分為可溶性蛋白質和不溶性蛋白質，其中約有一半的可溶性蛋白質是葉綠體蛋白質，即FI蛋白（Fraction I protein），其結晶為六角形、十二面體，大小為18 S，在其酶功能相關研究中又稱為核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（簡稱Rubisco）;另一半是其他可溶性蛋白質的復合物，即FII蛋白（Fraction II protein），大小為4～6 S[13]。煙草是唯一可以通過結晶大量提取FI蛋白的植物，鮮煙葉可溶性蛋白提取量如表1所示。

1?根據蛋白質溶解度不同進行分離提取

1.1?酸堿提取法

酸堿提取法是提取葉蛋白的傳統方法，也是目前應用較為廣泛的方法[15]，利用蛋白質等電點沉降和高溫變性的特點，通過對pH的調節及溫度的控制，使蛋白沉淀[16]，從而得到煙草葉片的粗蛋白。趙謀明等[17]以低次煙葉為原料，采用氫氧化鉀和磷酸調整pH，在料液比1：17、提取溫度60 ℃、pH 8.0的條件下磨漿2次;然后在溫度60 ℃，pH 8.0，時間60 min，攪拌條件下堿溶提取3次;最后在pH 3.0，4 ℃下靜置8 h，4800 r/min、20 ℃離心30 min，煙葉蛋白提取率最高可達86.71%。田少君等[18]在單因素試驗的基礎上，選擇pH、加熱時間和加鹽比例為自變量，以煙葉蛋白的提取率為響應值，研究各自及交互作用下對煙葉蛋白提取率的影響，結果得出pH和加熱時間對煙葉蛋白提取率的影響不存在交互作用，pH對煙葉蛋白提取率的影響更為顯著。衛青等[19]為回收薄片廠抄造段濃白水中的蛋白質，減少造紙法再造煙葉生產中有機物對環境的污染，分析pH對提取煙葉蛋白的影響，結果發現，

當堿沉pH一定時，煙葉蛋白在酸溶pH為3.5處沉淀量最大;當酸溶pH一定時，煙葉蛋白在堿沉pH為8.0處沉淀量最大，所以得到最佳提取工藝參數為酸溶pH=3.5，堿沉pH=8.0。

1.2?有機溶劑提取法

酚提法是一種常用的有機溶劑提取方法，用含有30 %（m/V）蔗糖的苯酚提取液充分溶解煙葉粉末，通過甲醇或丙酮沉淀對酚相中的蛋白進行純化和濃縮，而多糖、核酸等水溶性物質則留在水相中[20]，具有較高的分辨率。韋玉梅等[21]使用含十二烷基硫酸鈉（SDS）的緩沖液來增加煙葉蛋白的溶解度，利用酚在SDS這種陰離子型表面活性劑存在的條件下能充分溶解蛋白的特點，可以在較短的時間內充分溶解煙葉蛋白，得到較高純度的蛋白質，所獲雙向電泳（2-DE）圖譜中蛋白質點多且清晰，背景干凈，重復性好。尤垂淮等[22]以煙草主栽培品種K326為材料，比較了5種不同植物葉蛋白樣品制備方法對雙向電泳分析結果的影響，結果表明采用苯酚提取煙葉蛋白的方法較可靠，去除了煙草葉片酚類、色素和多糖等干擾蛋白質提取的物質，可以有效減少煙葉蛋白在提取過程中的損失，獲得的2-DE圖譜中蛋白質點數量最多，最清晰，分離效果好。

三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法是植物蛋白樣品制備最基本的方法，最初由DAMERVAL等[23]設計，利用蛋白質在酸性和疏水條件下變性的原理進行分離提取，并能有效去除污染物，達到富集蛋白質的效果。王紹美等[24]研究了旺長后期和苗期煙草葉蛋白樣品的制備方法，分別采用稍加改進的TCA/丙酮法和蛋白質分級提取、酚抽提及丙酮洗滌相結合的方法，建立了適用于不同發育時期煙草葉片蛋白質組研究的雙向電泳實驗體系。旺長后期的煙草葉蛋白樣品經過TCA/丙酮提取，預冷丙酮沉淀2次后，選用pH 4～7的17 cm IPG（immobilized pH gradient）預制膠條，上樣體積170 μL（總上樣量1 mg），可以得到重復性較好，蛋白質點清晰的2-DE圖譜;苗期煙草葉蛋白樣品通過蛋白質分級提取、酚抽提及丙酮洗滌后，選用pH 4～7的24 cm線性IPG膠條，水化12 h上樣，上樣體積450 μL（總蛋白量1.5 mg），可以得到背景干凈，蛋白質點清晰的2-DE圖譜。

1.3?雙水相萃取法

雙水相萃取法（ATPE）是一種易于放大、操作條件溫和、可連續化操作的新型提取技術。雙水相萃取與傳統的萃取原理相似，都是利用蛋白質在兩相間的選擇分配差異而進行分離純化，不同之處在于萃取體系的性質。當蛋白質進入雙水相體系后，在范德華力、疏水作用、靜電作用和界面張力的作用下，選擇性地富集到上相或下相，從而實現目標蛋白與雜質的選擇性分離[25]。BALASUBRAMANIAM等[26]研究了以蛋清溶菌酶（堿性蛋白）為模型蛋白使用ATPE從煙草蛋白中純化重組蛋白的適用性，通過改變聚乙二醇（PEG）的分子量、PEG濃度、無機鹽的種類和濃度、pH等條件來得到煙草蛋白在聚合物-鹽雙水相體系中的最佳分配系數。結果發現PEG/硫酸鈉系統最適合蛋清溶菌酶的純化，當滿足pH為7.0、PEG（分子量為3400）質量分數為10%、硫酸鈉質量分數為16.2%且氯化鈉濃度保持在0.19 mol/L時，可以得到蛋清溶菌酶87%的產率。ROSS等[27]研究了使用ATPE分離純化酸性蛋白的可行性，以煙草轉基因酸性重組蛋白β-葡萄糖醛酸苷酶（rGUS）為目標蛋白，通過部分析因設計（fractional factorial designs）的篩選實驗，確定了PEG/磷酸鉀為純化rGUS的最佳雙水相系統，經過響應面法（RSM）分析，當滿足pH為8.0、PEG（分子量為3400）質量分數為13.4%、磷酸鉀質量分數為18%且氯化鈉濃度保持在0.789 mol/L時，得到的rGUS回收率最大，可達74%。ATPE用于分離純化蛋白質是替代昂貴層析法非常有前景的方法，但大規模生產應用還需解決相系統的恢復問題。

1.4?結晶和重結晶法

結晶法是某種物質通過降溫或蒸發的方法在浸提液中以晶體狀析出的過程。初次結晶所獲得的晶體多含雜質，通過再次結晶可以獲得較純的晶體，這一過程也被稱為重結晶[28]。郭培國等[14]為了簡捷大量地提取煙葉中FI蛋白，經過反復研究和探索，發現新鮮煙葉經亞硫酸鈉溶液處理后再加入防褐變劑，可抑制或除去多酚氧化酶活性，大大降低粗提液的褐變程度;又根據FI蛋白多種物理化學特性與其他蛋白的差異，如鹽溶性、耐熱性、化學試劑反應等，初步將FI蛋白與其他蛋白分離及除去有色物質，在低溫等條件下加入少量FI蛋白晶體，保存2～3 d后，有大量白色晶體析出，再經過脫鹽處理，可以得到純凈的FI蛋白晶體，最終每千克鮮煙葉可提取FI蛋白5.12 g，FII蛋白6.27 g，總提取率為71.28 %。

2?根據蛋白質分子量不同進行分離提取

2.1?超濾膜法

膜分離技術是以壓力為推動力，依靠膜的選擇性，將液體中的組分進行分離的方法，包括微濾（MF）、超濾（UF）、納濾（NF）和反滲透（RO）4種。SHI等[29]采用中空纖維UF-NF-RO膜集成工藝從廢棄煙葉中提取純化煙葉蛋白，在連續的超濾和納濾中，煙葉蛋白的截留率分別達到87.9 %和98.5 %，所產生的廢水經中空纖維反滲透膜過濾后，可無害化處理。魏赫楠等[30]為優化超濾膜提取煙葉蛋白的工藝參數，以蛋白質截留率和滲透通量為綜合指標，系統討論了提取溫度、料液pH和操作壓強對煙葉蛋白提取率的影響，最終得到提取煙葉蛋白的最佳工藝參數為：提取溫度22 ℃、料液pH 5.0、操作壓強0.10 MPa，煙葉蛋白的平均截留率可達85.2%。膜分離過程沒有相變，能夠保持天然蛋白質的物理化學特性，但是膜兩側濃度差異和膜結垢會引起膜滲透通量減少，從而影響分離效果，因此需要定期清理膜污染或者增加膜的疏水性以提高膜的防污性能。

2.2?SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）是對蛋白質進行量化、比較及特性鑒定的常用方法，具有經濟、快速和可重復等特點，是依據蛋白質的分子量對其進行分離的提取技術。HEIDARI-JAPELAGHI等[31]為了在煙草中生產重組人干擾素-γ（hIFN-γ）蛋白，通過農桿菌侵染法使攜帶pCAMBIA-Zera-IFN-γ載體的GV3101菌株侵入煙草植株（N. tabacum cv. Samsun）中瞬時表達hIFE-γ蛋白，用1 mL提取緩沖液（50 mmol/L Na3PO4，pH 8.0;150 mmol/L NaCl;1 mmol/L EDTA;2%聚乙烯吡咯烷酮[PVP]）對研磨后約500 mg受侵染煙葉樣品充分浸提，在14000 r/min、4 ℃下離心20 min，去除沉淀后得到總可溶性蛋白（TSP），然后用濃度為12.5%的聚丙烯酰胺進行SDS-PAGE，分離出分子量為23 kDa的重組hIFN-γ蛋白;通過酶聯免疫吸附測定（ELISA）算出重組hIFN-γ蛋白濃度為19.18 μg/g，再對重組hIFN-γ蛋白進行抗病毒活性檢測，結果發現其有良好的抗病毒活性，且與標準hIFN-γ蛋白抗病毒水平相似。SEDAGHATI等[32]為了比較不同基因型煙草中人血清白蛋白（HSA）基因的瞬時表達水平，將攜帶pBI121-HSA二元載體的農桿菌菌株分別侵入N. benthamiana、N. tabacum cv. Xanthi和Samsun 3種基因型煙草植株中，稱取500 mg受侵染煙葉組織樣品研磨成粉末狀，用1 mL提取緩沖液（50 mmol/L Na3PO4，pH 7.0;150 mmol/L NaCl;1 mmol/L EDTA;2%聚乙烯吡咯烷酮[PVP]）充分浸提后，在13000 r/min、4 ℃下離心22 min，保留上清液，再經過12% SDS-PAGE分離得到分子量為66.5 kDa的重組HSA;通過蛋白質印跡法（Western Blot）進一步驗證了重組HSA在所有基因型煙草中均能成功表達，并用ELISA分析得出Samsun中的重組HSA表達量最高，分別是N. benthamiana的2.4倍、Xanthi的1.6倍，最高濃度約15.6 μg/g。

2.3?凝膠過濾法

凝膠過濾法是根據蛋白質分子量不同在色譜柱中的分配速度不同，分子量大的流出比分子量小的快，進而分離的方法。LOWE[33]將大量新鮮煙葉投入到少量濃氯化鈉溶液（5 mol/L）中進行勻漿，采用Sephadex G-50交聯葡聚糖凝膠柱對煙葉蛋白粗提液進行脫鹽除雜處理，結晶蛋白得率較高;但該方法操作難，容易損壞搗碎機，限制了蛋白結晶的制備規模[34]。

3?根據蛋白質所帶電荷不同進行分離提取

3.1?離子交換法

離子交換法是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的待分離組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而將混合物進行分離的一種提取方法。李立人等[35]在LOWE的方法基礎上，加入711陰離子交換樹脂作為小分子物質的吸附劑，用二乙氨乙基（DEAE）纖維柱代替交聯葡聚糖凝膠柱，0.1 mol/L的NaCl溶液作為勻漿液，過柱洗脫后通過稀釋結晶獲得大量FI蛋白晶體。LING等[36]將殼聚糖（CS）和羧甲基纖維素（CMC）混合在水溶液中，以戊二醛為交聯劑，二氧化硅顆粒為致孔劑，制備了大孔兩性離子交換膜（CS/CMC共混膜），能夠通過吸附-解吸過程從煙草提取液中分離蛋白質，結果發現在pH 6.15，吸附時間為8 h，蛋白質初始濃度為1.52 mg/mL，CS/CMC重量為0.05 g（質量比4：1）的條件下，達到最大蛋白吸附量為271.78 mg/g;再調節pH至9.40以改變料液靜電力，實現較高的解吸能力和解吸效率，成功從煙草提取液中分離出煙草蛋白，且CS/CMC共混膜在3個吸附-解吸循環后仍顯示出良好的可重復使用性。

3.2?雙向電泳法

帶電荷的供試品（蛋白質粗提液）在惰性支持介質（如醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區帶，達到對不同目標物質的分離[37]。溶液的pH決定了蛋白質的凈電荷和解離程度，當溶液的pH>pI時，蛋白質帶負電，當溶液的pH

4?根據蛋白質分子的配體專一性進行分離提取

親和層析法是基于生物分子間天然特異性的相互識別，具有高度選擇性，可以從大量復雜溶液中分離少量的包括抗體在內的特定蛋白質的一種提取方法。DAVOODI-SEMIROMI等[41]將霍亂毒素B亞基基因（Cholera toxin-B subunit，CTB）分別與惡性瘧原蟲的頂端膜抗原-1基因（Apical membrane antigen-1， AMA1）和裂殖子表面蛋白-1基因（Merozoite surface protein-1，MSP1）進行融合構建表達載體并轉化煙草葉綠體后，利用霍亂毒素（CT）能與B亞基介導的Ni2+離子特異性結合的特點，使用TALON Superflow金屬親和樹脂（Clontech，Mountain View，CA，USA）進行固相金屬親和層析（IMAC）提取融合蛋白，發現CTB-AMA1和CTB-MSP1的表達量分別占TSP的13.17%和10.11%;通過皮下注射純化的抗原或用煙草葉片飼喂小鼠后，發現葉綠體表達的CTB-AMA1和CTB-MSP1具有免疫原性。NASAB等[42]為了從轉質體煙草植株中分離純化重組組織型纖溶酶原激活劑（rtPA）蛋白，將6個組氨酸和1個Xa因子蛋白酶位點序列與截短型組織纖溶酶原激活劑（K2S）蛋白序列的C-端進行融合構建表達載體并轉化到煙草葉綠體，完成組氨酸標記，利用帶負電的組氨酸標記蛋白能與固相化金屬離子介質Ni2+離子特異性結合的特點，使用Ni-NTA瓊脂糖樹脂進行IMAC提取純化組氨酸標記的rtPA，然后將純化的樣品用蛋白酶因子Xa（Sigma Cat. No. F9302）處理，并在37 ℃下孵育2.5 h以去除組氨酸標記，最終每100 mg鮮質量的葉片組織得到30.6 μg rtPA，約占TSP的1%。

5?其他提取方法

煙草葉蛋白的提取方法還有直接加熱法、泡沫分離法、硫酸銨沉淀等，也有將多種提取方法綜合在一起使用的。直接加熱法操作簡單、成本較低，將煙葉磨碎或在加有還原劑的情況下，把已粉碎的漿狀物加熱到50 ℃左右熱凝聚，用高速離心去除脂溶性葉綠素部分，將含有所需蛋白質的液體從勻漿中分離出來，冷卻后產生FI蛋白結晶[5]。泡沫分離法是根據表面吸附原理，利用通氣在液相中形成的氣泡為載體，對液相中的溶質或顆粒進行分離，CROFCHECK等[43]利用組氨酸標記蛋白（His-protein）能與表面活性劑和金屬離子形成復合物的特點，選擇組氨酸標記的β-葡萄糖醛酸苷酶（His-gus）為目標蛋白，在煙草提取液中加入N-ε-dodecylamido-N-ɑ，N-ɑ，-bis（carboxymethyl）-L-lysine（DCL）表面活性劑和Ni2+離子，然后經過泡沫分餾裝置產生的氣泡進行分離純化，最終得到His-gus的回收率為88%，濃縮比（泡沫中蛋白質的濃度與初始溶液的蛋白質濃度的比值）為2.27。硫酸銨沉淀是利用不同濃度硫酸銨溶液對蛋白質進行沉淀和分離的方法，通常與其他提取技術組合使用;徐凡等[44]為提取純化煙草葉片中的谷草轉氨酶（GOT），先后經過硫酸銨沉淀、Sephadex G-100凝膠過濾和DEAE-Sepharose陰離子交換層析重復分離純化后，最終GOT的得率為1.4%。

6?展?望

近年來，隨著現代生物化學技術的飛速發展，蛋白質分離提取技術也取得了長足的進步。酸堿沉淀法、有機溶劑提取法、鹽析法等傳統提取技術可以粗略地分離目標蛋白，但存在分辨率低、雜質多、操作較為繁瑣等缺點。層析法、電泳法屬于高精度分離技術，可以進一步純化蛋白質，但獲得的純化蛋白質量少。而超濾膜分離、雙水相萃取等現代分離提取方法具有高效、快速、自動化等優勢，已成為目前煙草蛋白質大量分離純化的主流技術，得到廣泛應用。另外，利用煙草生物反應器生產外源重組蛋白是一個有吸引力的廉價生產系統，可以用來生產一系列的藥用蛋白[45]，包括抗體、疫苗和細胞因子等，具有成本低、安全性好、表達產物具有與高等動物細胞一樣的免疫原性和生物活性等優點[46]，但目前尚存在目標蛋白表達量低、穩定性較差、口服疫苗易耐受等問題。單一的分離技術通常無法得到較好的提取效果，但如果根據目標蛋白特性，組合多種分離技術，合理設計分離提取工藝，就能實現理想的分離純化效果。隨著新理論、新材料和新思路的涌現，新型分離技術將會向集成化、智能化、小型化的方向發展，其在煙草葉蛋白分離提取方面也將具有不可估量的潛力。

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