擬環紋豹蛛轉錄組數據SSR序列特征分析

劉靖 魏俞虹 肖榕

摘 要：擬環紋豹蛛Pardosa pseudoannulata是稻田害蟲重要的自然天敵，在綠色防控中有重要作用。本研究基于擬環紋豹蛛轉錄組數據，使用微衛星鑒定工具軟件（MISA） 挖掘和分析其簡單序列重復（SSR）位點。結果表明：擬環紋豹蛛轉錄組Unigene序列中共檢測到6474個SSR位點，平均長度為12.36 bp，分布于4411條Unigene上。單核苷酸重復類型為擬環紋豹蛛轉錄組SSR位點的主導基序類型，共5025個，占總SSR位點的77.62%;在擬環紋豹蛛轉錄組序列識別的6474個SSR中共發現了53種重復基元，從單核苷酸到五核苷酸重復基元分別有2種、6種、27種、15種和3種，其中（A/T）基元類型占明顯優勢，占總SSR的74.44%。擬環紋豹蛛轉錄組SSR位點豐富，有較高的多態性潛能，可作為開發SSR標記的有效來源，為擬環紋豹蛛的遺傳多樣性分析、功能基因的開發利用等方面的研究奠定基礎。

關鍵詞：擬環紋豹蛛;轉錄組;SSR;重復基元

中圖分類號：Q346+.5;Q959.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2021）04-0031-07

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.04.005

Abstract：The wolf spider Pardosa pseudoannulata is an important biological control agent of rice pests and plays an important role in green prevention and control.In this study，based on the transcriptome data of P.pseudoannulata，we used MISA （microsatellite identification tool） to analyze its SSR （simple sequence repeat） loci.The results showed that a total of 6474 SSR loci were detected in the Unigene sequence of the transcriptome data，with an average length of 12.36 bp，distributed on 4411 Unigenes.The Mono-nucleotide repeat type were the dominanttype，its number was 5025，accounting for 77.62% of the total SSR loci.The 6474 SSR lociwere identified 53 repetitive motifs，there were 2，6，27，15 and 3 repetitive motifs from Mono-nucleotide to Hexa-nucleotide.（A/T）was dominant repetitive motif，accounting for 74.44% of the total SSR.The SSR loci of transcriptome in P.pseudoannulata were rich and high polymorphism potential. Our results can be used as an effective source for the development of SSR marker and provide foundation for research of genetic diversity and development functional genes of P.pseudoannulata.

Keywords：Pardosa pseudoannulata;transcriptome;SSR;repeat motif

擬環紋豹蛛Pardosa pseudoannulata屬于蛛形綱Arachnida蜘蛛目Araneae狼蛛科Lycosidae豹蛛屬Pardosa，在我國分布較廣，是稻田生態系統中優勢種蜘蛛，尤其在我國南方的廣東[1]、湖南[2]、湖北[3]、云南[4]、貴州[5]等地區常年可見。擬環紋豹蛛屬于中型蜘蛛，成蛛體長可達到13 mm，雌雄蛛均可多次交配，雌蛛每次平均產卵156粒，孵化的幼蛛群集在雌蛛背面3～7 d后才離開，幼蛛期47～158 d，成蛛期121～236 d，雌蛛較雄蛛長21～62 d[2，6-7]。擬環紋豹蛛是稻田害蟲的重要捕食性天敵，其空間生態位寬[6，8]，能夠在水面、稻株上、地面上等多種環境捕食褐飛虱Nilaparvata lugens、白背飛虱Sogatella furcifera、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis、黑尾葉蟬Nephotettix bipunctatus等害蟲。在稻田中捕食飛虱和葉蟬，90%是狼蛛科蜘蛛的功勞[9-13]。擬環紋豹蛛的性情兇猛，專捕活蟲，即使飽食，也會把獵物咬死后才休止，食量也大，2齡幼蛛每頭每天平均捕食黑腹果蠅Drosophila melanogaster 4.36頭，成蛛每頭每天捕食水蠅Hydrellia sp.可達30頭[8，14]，雌成蛛對亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis 2齡幼蟲的捕食上限為116頭[15]，王智等[16]研究表明低劑量農藥對擬環紋豹蛛捕食褐飛虱的能力有增強作用。本課題組前期對擬環紋豹蛛的求偶交配行為[17]、選擇行為[18]和溫度脅迫[19-20]和SNP位點[21]等方面進行了研究。目前，擬環紋豹蛛轉錄組SSR位點分析未見報道。

微衛星（microsatellite），又稱為簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR），是指以1～6個核苷酸為重復單元串聯組成的重復序列，串聯重復10～60次組成的簡單重復序，微衛星具有高多態性、共顯性、高可重復性、數量豐富等優點[22-23]。因此，微衛星在遺傳分析中可以作為一種理想的分子標記，已被廣泛應用于生物遺傳研究中，在苦蕎Fagopyrum tartaricum[24]、密花香薷Elsholtzia densa[25]、密葉紅豆杉Taxus fuana[26]、金佛山方竹Chimonobambusa utilis[27]等植物;麥紅吸漿蟲Sitodiplosis mosellana[28]、蚜蟲[29]、小胸鱉甲Microdera punctipennis[30]、桔小實蠅Bactrocera dorsalis[31]、溝渠豹蛛Pardosa laura[32]等動物中進行了報道。本文基于擬環紋豹蛛轉錄組測序數據，對其SSR特征進行分析，旨在為SSR標記在該物種的遺傳多樣性分析、功能基因的開發利用等方面提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試蟲源

擬環紋豹蛛的亞成蛛采集于廣州市華南農業大學試驗田（113.7°E，23.17°N）。亞成蛛采回后單頭放入玻璃試管（ 長100 mm，直徑25 mm） 中飼養，試管底部用一塊蘸水的海綿保濕，管口塞有海綿塞，防止蜘蛛逃逸，置于人工氣候箱內（25±0.5）℃，相對濕度RH為60%±10%，光周期為14 L：10 D飼養。每周飼喂2次，每次飼喂4～6頭活家蠅Musca domestica成蟲，同時給試管底部的海綿添加足量的水以保持濕潤。每隔1 d觀察記錄擬環紋豹蛛蛻皮及成熟情況，成熟兩周后的蜘蛛用液氮速凍后置-80 ℃冰箱備用。

1.2?SSR位點的檢測

當蜘蛛成熟14 d后，使用TRIzol試劑盒提取蜘蛛的總RNA，經質量檢測合格的樣品，送北京百邁客生物科技有限公司利用Illumina HiseqTM 2500平臺進行轉錄組測序，測序結果用Trinity軟件進行數據組裝獲得Unigene。利用MISA（MIcroSAtellite identification tool，http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）軟件對擬環紋豹蛛轉錄組中的Unigene進行SSR位點檢測。檢測的重復序列從單堿基重復至六堿基重復，篩選參數：單核苷酸序列重復次數不低于10次，二核苷酸序列重復次數不低于6次，三核苷酸序列、四核苷酸序列、五核苷酸序列和六核苷酸序列重復次數則不低于5次。若2個SSR間距小于100 bp，則組成一個復合SSR位點。

2?結果與分析

2.1?擬環紋豹蛛轉錄組分布概況

組裝后的擬環紋豹蛛轉錄組數據，共獲得67 725條Unigene，篩選長度1 kb以上的13 762條Unigene，利用MISA軟件分析發現，SSR重復序列總共有6474個，分布在4411條Unigene上，擬環紋豹蛛轉錄組Unigene序列平均每4581 bp就出現一個SSR位點。包含1個以上SSR位點數的Unigene數目1347條（表1）?？梢?，擬環紋豹蛛轉錄組所包含SSR位點較豐富，且分布較廣泛。

2.2?擬環紋豹蛛轉錄組SSR位點不同重復類型分析

對擬環紋豹蛛轉錄組搜索的SSR位點進行了核苷酸重復類型分類，共有5種重復類型（表2）。不同重復類型形成的SSR位點數目相差較大，其中單核苷酸重復位點最多，為5025個，占總SSR位點的77.62%，總長度為62 117 bp，平均每477 bp出現1個單核苷酸重復序列，單核苷酸平均長度為12.36 bp;二核苷酸重復SSR位點，為985個，占總SSR位點的15.21%，總長度為13 868 bp，平均每2138 bp出現1個二核苷酸重復序列，二核苷酸平均長度為14.08 bp;三核苷酸重復SSR位點，為421個，占總SSR位點的6.50%，總長度為6918 bp，平均每4287 bp出現1個三核苷酸重復序列，三核苷酸平均長度為16.43 bp;四核苷酸重復SSR位點，為40個，占總SSR位點的0.62%，總長度為824 bp，平均每35 990 bp出現1個四核苷酸重復序列，四核苷酸平均長度為20.60 bp;五核苷酸重復SSR位點最少，為3個，占總SSR位點的0.05%，總長度為90 bp，平均每329 506 bp出現1個五核苷酸重復序列，五核苷酸平均長度為30.00 bp。不同重復類型形成SSR頻率差異較大，其中單核苷酸重復類型SSR發生頻率最高，每100條Unigene有36.51個SSR位點出現;五核苷酸重復類型SSR發生頻率最低，100條Unigene僅有0.02個SSR位點出現（表2）。

2.3?擬環紋豹蛛轉錄組SSR基元類型分析

在擬環紋豹蛛轉錄組序列識別的6474個SSR中共發現了53種重復基元，其中單核苷酸重復基元有2種、二核苷酸重復基元有6種、三核苷酸重復基元有27種、四核苷酸重復基元有15種、五核苷酸重復基元有3種。不同基元類型形成SSR位點數目存在差異，從總體來看，隨著SSR基元堿基數目的增加，SSR位點數呈下降趨勢。其中單核苷酸基元（A/T）發生頻率最高為35.02%，其次是（AT/AT）的2.81%、（TA/TA）的2.03%、（C/G）的1.50%、（AC/GT）的0.80%等（表3）。

在單核苷酸重復基元中，（A/T）基元類型占明顯優勢，共形成4819個SSR位點，占單核苷酸SSR位點的95.90%，總SSR位點的74.44%，屬于單堿基的優勢重復基元（圖1，表3）。在二核苷酸重復基元中（AT/AT）和（TA/TA）基元類型占明顯優勢。（AT/AT）基元類型共形成387個SSR位點，占二核苷酸SSR位點的39.29%，占總SSR位點的5.98%;其次是（TA/TA）基元類型，共形成280個SSR位點，占二核苷酸SSR位點的28.43%，占總SSR位點的4.32%（圖1，表3）。在三核苷酸重復基元中（AAT/ATT）、（TCA/TGA）、（TAA/TTA）基元類型占明顯優勢。（AAT/ATT）基元類型形成46個SSR位點，占三核苷酸SSR位點的10.93%，占總SSR位點的0.71%;（TCA/TGA）基元類型形成39個SSR位點，占三核苷酸SSR位點的9.26%，占總SSR位點的0.60%;（TAA/TTA）基元類型形成37個SSR位點，占三核苷酸SSR位點的8.79%，占總SSR位點的0.57%（圖1，表3）。在四核苷酸重復基元中（TAAA/TTTA）和（AAAT/ATTT）基元類型占明顯優勢。（TAAA/TTTA）基元類型共形成8個SSR位點，占四核苷酸SSR位點的20.00%，占總SSR位點的0.12%;其次是（AAAT/ATTT）基元類型，共形成7個SSR位點，占四核苷酸SSR位點的17.50%，占總SSR位點的0.11%（圖1，表3）。在五核苷酸重復基元中（AACCT/AGGTT）、（TTTTA/TAAAA）、（ATATA/TATAT）基元類型，每一種類型都只形成1個SSR位點，占五核苷酸SSR位點的33.33%，占總SSR位點的0.02%（圖1，表3）。

2.4?擬環紋豹蛛轉錄組SSR重復次數分析

擬環紋豹蛛SSR基元重復次數在不同基元類型間存在差異，不同重復次數所形成的SSR位點差異較大，每種類型構成的SSR位點中，最小重復次數的SSR位點最多，且隨著基元堿基數目的增加，重復次數類型呈下降趨勢（圖2）。單核苷酸重復基元的重復次數類型最多，共有15種重復次數，不同重復次數所形成的SSR位點數量差異較大，最小重復次數為10次，形成2210個SSR位點，占單核苷酸SSR位點的43.98%，最大重復次數為24次，僅形成1個SSR位點，占單核苷酸SSR位點的0.02%。二核苷酸重復基元共有8種重復次數類型，其中最小重復次數為6次（505個，51.26%），最大重復次數為13次（1個，0.10%）。三核苷酸重復基元共有6種重復次數類型，其中最小重復次數為5次（278個，66.03%），最大重復次數為10次（1個，0.24%）。四核苷酸重復基元共有2種重復次數類型，最小重復次數為5次（34個，85%），最大重復次數為6次（位點數：6個，15%）。五核苷酸重復基元的共有3種重復次數類型，其中最小重復次數為5次（1個，33.33%），最大重復次數為7次（1個，33.33%）。

2.5?擬環紋豹蛛轉錄組SSR長度分析

影響SSR多態性的主要因素是SSR序列的長度，SSR序列長度與其多態性成正比。SSR序列長度<12 bp時，SSR多態性很低;12 bp≤SSR序列長度<20 bp時，SSR多態性良好;SSR序列長度≥20 bp時，SSR多態性較高[27，33]。對擬環紋豹蛛轉錄組SSR長度進行分析，SSR長度在10～35 bp之間，平均長度為12.95 bp（表2，圖3）。其中數量最多的SSR序列長度為12～19 bp，占比為47.28%;其次是長度小于12 bp SSR序列，占比為46.18%;然后是SSR序列長度為20～35 bp，占比為6.53%，總體來看，SSR多態性屬于良好（圖3）。

3?結論與討論

本研究基于擬環紋豹蛛轉錄組數據，共獲得67 725條Unigene，篩選長度1 kb以上的13 762條Unigene，利用MISA軟件共檢測到6474個SSR位點，分布于4411條Unigene上，SSR出現頻率為47.04%。擬環紋豹蛛轉錄組SSR出現頻率明顯高于荔枝蒂蛀蟲Conopomorpha sinensis（15.25%）[34]、印度谷螟Plodia interpunctella（8.52%）[35]、小胸鱉甲M.punctipennis（7.94%）[30]、麥紅吸漿蟲S.mo-sellana（3.49%）[28]等昆蟲。不同物種間SSR位點出現頻率的差異，可能是與不同物種基因組特點有關，也可能和測序深度、篩選SSR的軟件及檢測時選擇的參數等因素有關。如，本研究與溝渠豹蛛P.laura（80.11%）[32]的研究相比，研究對象都屬于豹蛛屬蜘蛛，設定參數也相同，均是對大于1 kb的Unigene進行SSR搜索，但檢測到的SSR數量和SSR出現的頻率存在明顯的差異。

擬環紋豹蛛轉錄組搜索的SSR位點進行了核苷酸重復類型分類，共有5種重復類型，單核苷酸重復位點為5025個、二核苷酸重復SSR位點為985個、三核苷酸重復SSR位點為421個、四核苷酸重復SSR位點為40個、五核苷酸重復SSR位點為3個。擬環紋豹蛛轉錄組SSR位點的主導基序類型是單核苷酸重復類型，占總SSR位點的77.62%，高于馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata（63.23%）[36]、梨網蝽Stephanitis nashi（40.41%）[37]、麥紅吸漿蟲S.mosellana（37.07%）[28]、小胸鱉甲M.punctipennis（47.17%）[30]等昆蟲，與溝渠豹蛛P.laura（72.67%）[32]相差不大，低于窄足真蚋Simulium（Eusimulium）angustipes（87.05%）[38]。擬環紋豹蛛轉錄組中共發現了53種重復基元，從單核苷酸到五核苷酸重復基元分別有2種、6種、27種、15種和3種，其中單核苷酸（A/T）基元類型占總SSR的74.44%，占明顯優勢，這與溝渠豹蛛P.laura[32]、馬鈴薯甲蟲L.decemlineata[36]、麥紅吸漿蟲S.mosellana[28]、小胸鱉甲M.punctipennis[30]等轉錄組SSR分析研究結果相似。二核苷酸重復基元中，（AT/AT）是優勢基元，分別占總SSR的5.98%，這與溝渠豹蛛P.laura[32]分析研究結果相似。但在擬環紋豹蛛轉錄組SSR中，不含二核苷酸重復基元（GC/CG），這與桔小實蠅B.dorsalis[31]及褐飛虱N.lugens[39]的研究結果相似，（GC/CG）是非常稀有的重復基元，其數量幾乎接近零，推測（GC/CG）重復基元在不同物種的基因組中都可能是相當稀有的SSR。三核苷酸重復基元中，（AAT/ATT）基元占優勢，與褐飛虱（AAG/CTT）[39]、麥紅吸漿蟲（AAC/GTT）[28]、小胸鱉甲（CCG/GCC）[30]不同，與溝渠豹蛛[32]相同，（AAT/ATT）基元占優勢，可能是由于高滑變率及其作為終止密碼子的延伸區引起的[40]。

綜上所述，本研究基于擬環紋豹蛛轉錄組數據篩選得到其SSR位點信息，對不同類型位點的數量、比例、頻率與重復次數，以及對不同的重復基元類型的數量和比例等進行了分析，以期為研究擬環紋豹蛛的遺傳多樣性分析、功能基因的開發利用等方面的研究奠定基礎。

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