基于雙邊擬合的高穩定性共焦拉曼光譜定焦方法

張蕊蕊， 趙維謙， 王 允， 邱麗榮

北京理工大學光電學院精密光電測試儀器及技術北京市重點實驗室， 北京 100081

引 言

共焦拉曼光譜技術同時繼承了拉曼光譜的“分子指紋”特性和共焦顯微技術的高分辨層析成像特性， 被廣泛應用于材料科學[1]、 生物醫學[2]、 物理化學[3]等領域。 由于共焦拉曼系統采用“點”激發和“點”探測的探測機制， 而且拉曼散射光譜信號強度微弱， 因此單點探測需要的積分時間較長， 導致整個成像時間可長達數小時甚至數十小時[4-5]。 在常規共焦拉曼光譜技術的成像過程中， 系統的軸向位置通常被認為是不變的。 但是， 在漫長的測量過程中系統容易受環境溫度變化、 空氣擾動等影響產生漂移， 導致樣品不再位于焦平面位置， 樣品的離焦會降低光譜信號強度以及拉曼圖像分辨率[6-7]。 在大數值孔徑的共焦拉曼系統中， 當離焦量大于1 μm時， 拉曼圖像的分辨率下降量超過15%， 從而導致生成的圖像模糊。 因此， 高精度定焦是補償系統漂移并保證高圖像質量的關鍵。

為了補償系統漂移的影響， 通常采用以下兩種方法： (1)在共焦拉曼系統中添加輔助聚焦光路， 用于確定探測過程中焦面的位置[8-12]。 例如， 彩色共焦顯微鏡[8-10]通過物鏡使白光沿光軸聚焦， 并根據反射光的波長確定樣品的表面位置。 該方法具有較寬的測量范圍(毫米量級)， 但其定焦精度相對較低(微米量級)。 基于圖像分析[11-12]的聚焦方法使用CCD采集不同軸向位置的樣品圖像， 然后利用具有最大對比度的圖像確定樣品位置， 該方法對于物鏡的焦平面和CCD像平面的共軛光學以及樣品表面的反射率均勻性均有嚴格的要求。 (2)可利用擬合拉曼光譜強度軸向響應曲線頂點確定焦點位置[13-14]。 通過快速掃描獲取不同軸向位置處的光譜強度信號， 并使用最大強度確定樣品表面的位置。 該方法系統結構簡單， 并且對樣品的反射率沒有嚴格要求。 然而， 由于拉曼光譜強度軸向響應曲線在焦平面附近的軸向靈敏度較低， 限制了共焦拉曼系統的定焦精度。

為了提高共焦拉曼系統的定焦精度， 本文提出了一種雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法(bilateral fitting subtraction confocal Raman microscopy， BFSCRM)。 該方法利用拉曼光譜軸向強度響應曲線關于焦平面位置左右對稱的特點， 分別直線擬合半高寬附近處的軸向位置敏感的兩段區間數據， 然后將兩條擬合直線相減獲得差分直線， 最后通過差分直線過零點的位置對系統精確定焦。 該方法提高了系統定焦的靈敏度和精度， 且具有較好的抗噪能力。 通過該方法補償了測量過程中的離焦誤差， 提高了成像的穩定性， 進而保證共焦拉曼圖像具有較高質量。

1 原理及仿真

1.1 共焦拉曼系統原理

共焦拉曼系統原理如圖1所示。 激光經過擴束器準直擴束后被Notch Filter反射進入顯微物鏡， 并聚焦于被測樣品表面， 激發出載有樣品微區物質組分信息的拉曼散射光， 拉曼散射光經過顯微物鏡后透過Notch Filter， 被會聚鏡聚焦于共焦針孔， 最后被光譜儀收集。 通過二維掃描臺帶動樣品進行橫向掃描， 通過物鏡驅動器帶動顯微物鏡實現高精度的軸向掃描。 在共焦拉曼系統中激發光源、 樣品表面和共焦針孔分別位于彼此的共軛位置， 因此樣品的離焦散射光會被針孔屏蔽， 光譜儀只能接收來自受激發的樣品表面拉曼散射光， 從而保證了共焦拉曼光譜顯微系統具有較高的空間分辨力。

圖1 共焦拉曼原理圖Fig.1 Diagram of confocal Raman microscopy

1.2 雙邊擬合算法仿真分析

雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法的定焦原理如圖2所示。 可以看出， 在I=0.5附近， 拉曼光譜強度軸向響應曲線光譜強度I隨離焦量u的改變而迅速變化， 并且曲線在該區域內的變化趨近于線性關系。 分別對曲線兩側的部分區域進行線性擬合， 可以得到擬合直線IA和IB。 假設這兩條直線的斜率分別為kA和kB， 截距分別為cA和cB則這兩條直線可表示為

圖2 雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法定焦原理Fig.2 The relationship between the lateralFWHM and the defocusing amount u

將上述兩條直線方程相減后得到差分直線ID， 其對應的方程

ID=IA-IB=kAu+cA-kBu-cB

=(kA-kB)u+(cA-cB)

(2)

由于拉曼光譜強度軸向響應曲線關于焦平面位置對稱， 因此差分直線ID的過零點zf的橫坐標對應著共焦拉曼系統焦平面的位置。 且由對稱性可知kA≈-kB， 差分直線ID的斜率約為2kA， 說明雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法擁有較高的定焦靈敏度。

依據雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法定焦原理， 擬合區域內數據的線性度會對雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法的定焦精度產生影響。 在圖2中， 用于雙邊擬合的區域表示為[RI×max(I(u)),RS×max(I(u))]， 其中RS和RI分別是擬合的區域因子上限和下限， 且都在區間[0,1]內取值。 本文采用擬合優度判定因子R2對所取區間的線性度進行判定[15]， 為兼顧擬合優度、 系統信噪比和擬合的數據量， 本文RI和RS取值分別為0.4和0.8， 此時擬合優度R2=0.999 8。

在實際測量中， 共焦拉曼系統的系統誤差、 隨機噪聲及軸向掃描間隔均會對雙邊擬合算法的定焦精度產生影響。 系統誤差主要是光學系統在裝調時所產生的像差， 由Seidel像差公式可知， 像差主要由初級球差A040、 像散A022、 慧差A031、 場曲A120以及畸變A111， 由于共焦拉曼系統是共軸系統， 因此系統的慧差、 場曲以及畸變一般較小， 而球差和像散較大。 另外通常用信噪比(SNR)評估隨機噪聲對系統的影響。 本文仿真了不同掃描間隔時， 系統誤差和隨機噪聲對定焦精度的影響。 在仿真分析時， 歸一化的軸向定焦結果的均方根誤差(RMSE)被用于評價定焦精度。

從圖3(a)和(b)可以看出， 在較大的掃描步距下， 球差和像散對雙邊擬合共焦拉曼系統RMSE影響很小， 即系統像差的變化對定焦結果影響較小。 由圖3(c)可以看出， 雙邊擬合共焦拉曼光譜探測系統的RMSE隨著信噪比的降低而增大， 當信噪比為50 dB時， 其RMSE仍小于0.07， 說明雙邊擬合共焦拉曼光譜探測算法具有良好的抗隨機噪聲能力。

圖3 (a)不同球差下掃描間隔對RMSE的影響； (b)不同像散下掃描間隔對RMSE的影響； (c)不同信噪比下掃描間隔對RMSE的影響Fig.3 (a) Influence of axial scanning pitch on RMSE at different spherical aberration； (b) Influence of axial scanning pitch on RMSE at different astigmatism； (c) Influence of axial scanning pitch on RMSE at different SNR

通過以上仿真分析， 可以看出雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法具有很好的抗干擾能力， 并且可以在較大的軸向掃描間隔上實現高精度定焦， 說明雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法可以通過使用少量采樣點獲得焦平面位置， 減小成像所需的時間。

2 實驗與結果討論

根據圖1所示的原理構建了共焦拉曼系統的實驗驗證裝置。 激光器選用波長為532 nm固體激光器， 顯微物鏡數值孔徑為0.9， 放大倍率100倍。 物鏡驅動器選用PI公司P725-4CD納米驅動系統， 閉環分辨率為1.25 nm； 二維掃描臺選用PI公司P-542.2CD掃描臺， 閉環分辨力為0.4 nm。 收集針孔的大小為100 μm； 光譜儀使用天津港東科技有限公司LRS-5型號， CCD選用Andor公司的iDUs 416型號。

以單晶硅為待測樣品， 設置光譜的收集時間為0.1 s， 用物鏡驅動器帶動顯微物鏡沿軸向對單晶硅樣品進行掃描， 物鏡驅動器的步進間隔設置為50 nm。 光譜儀采集每步的拉曼光譜并提取各拉曼光譜在520.7 cm-1強度值， 拉曼光譜軸向響應曲線如圖4所示。

圖4 雙邊擬合的實際拉曼光譜強度軸向響應曲線和聚焦結果CI： 實際曲線； lL， lR： 擬合線；lD： 差分直線； zf=199.695 μm為焦點位置Fig.4 Actual axial response curve andfocusing result of BFSCRM

通過雙邊擬合算法求得的兩條擬合直線相減后所得差分直線lD的過零點zf的橫坐標為199.695 μm， 該坐標對應共焦拉曼系統聚焦在樣品表面位置時物鏡驅動器所在的位置。 為了驗證雙邊擬合拉曼測量方法的軸向定焦能力， 對單晶硅表面同一位置進行了60次重復定焦實驗。 其中， 軸向的掃描步距為100 nm， 所得的定焦結果如圖5所示。 從圖5中可得60次重復定焦的極差為80.2 nm， 標準差為21 nm。

圖5 雙邊擬合定焦方法的定焦重復精度Fig.5 Focusing repetition accuracy of BFSCRM

為了進一步驗證雙邊擬合拉曼測量方法的定焦能力及其對拉曼mapping成像穩定性的改善程度， 測試樣品為周期5μm的豎條柵格標準原子力臺階TGXYZ02， 該樣品是在硅(Si)襯底上覆蓋100 nm不同結構的二氧化硅(SiO2)臺階陣列。 樣品在共焦顯微鏡(LEXT OLS400,Olympus)下觀測到的白光圖像如圖6(a)所示， 其結構的示意圖如圖6(b)所示。 圖6(c)是圖6(b)中A點的拉曼光譜， 在實驗中， 我們選取520.7 cm-1處硅的拉曼峰進行成像。 設置mapping掃描像素尺寸32×64， 橫向掃描間隔為250 nm， 曝光時間為0.5 s。 然后對圖6(a)中樣品的被測區域B進行掃描。 在進行定焦掃描時， 每4個點進行一次定焦。 實驗獲取樣品拉曼mapping圖像如圖7所示。

圖6 (a)樣品顯微形貌； (b)圖(a)中紅色虛線位置放大示意圖； (c)圖(a)中A點拉曼光譜Fig.6 (a) microscopic observation image； (b) zoom-in the area shown in red area of (a)；(c) Raman spectrum of point A in (a)

圖7 5 μm周期樣品的拉曼圖像(a)： 無定焦系統的拉曼圖像； (b)： BFSCRM系統拉曼圖像Fig.7 Raman images of a vertical bar with a 5 μm period(a)： Without auto-focusing； (b)： Using BFSCRM

圖7(a)是沒有使用任何定焦方法所獲得的拉曼mapping圖像。 圖7(b)為雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法對被測區域進行掃描所獲得的拉曼mapping圖像。 從圖7(a)中可以看出， 在對樣品掃描過程中， 由于系統漂移或者振動導致樣品被測區域逐漸離焦， 豎條柵格圖像的下半部分出現模糊的現象， 導致圖像分辨率的下降。 通過圖7(b)和圖7(a)相比， 可以發現雙邊擬合共焦拉曼系統獲得的豎條柵格圖像不會出現逐漸模糊的現象， 圖像更為清晰， 而且在容易引入誤差的豎條柵格邊緣圖像更銳利， 且信噪比較高。 實驗結果表明， 雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法能夠更好的消除誤差變化對定焦結果的影響， 較好地補償傳統共焦拉曼系統因漂移、 振動或表面不平整所導致的樣品離焦， 提高了系統的穩定性， 從而保證了成像質量。

3 結 論

提出了一種雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法， 提高共焦拉曼光譜技術的拉曼成像質量。 該方法利用共焦拉曼光譜軸向響應曲線的斜邊對探測點進行定焦處理， 消除了系統離焦對實驗結果的影響， 從而確保了系統探測的穩定性。 實驗結果表明該方法具有定焦準確、 抗漂移的效果。 隨著拉曼光譜應用的深入， 對系統性能的要求也不斷增加， 基于雙邊擬合共焦拉曼光譜探測方法將在微電子和材料科學等領域有更廣泛的應用。