玉米ZmCCT基因缺失區段原核表達載體的構建與蛋白表達

徐 陽，崔麗娥，趙新玉，張兆恒，王 麗，宋亞申，王維香

(北京農學院植物科學技術學院，北京102206)

玉米(ZeaMaysL.)是全球普遍種植的糧、飼兼用的重要作物[1-2]。玉米莖腐病是一種真菌性玉米病害，嚴重危害世界各玉米產區的生產[1]。玉米莖腐病一般在玉米生長過程中的乳熟期達到發病高峰，而此時正是玉米形成果穗的關鍵時期。玉米莖腐病危害嚴重，且進一步呈上升趨勢，發病率一般為15%～20%，嚴重時可高達80%，玉米產量損失最高可達20%[3-7]。玉米莖腐病病情的逐年加重已成為玉米生產中亟待解決的問題并成為限制玉米生產的重要因素之一[8]。發掘更好的抗性種質資源、克隆和鑒定新的抗性基因和深入探究玉米響應病原物侵染的分子作用機理，將會為種質資源創新和培育抗性品種提供理論基礎。

早期研究表明，植物數量抗性位點(Quantitative Resistance Loci，QRL)對病原菌表現出部分抗性，這種抗性通常能夠持久保持，對抗的病原菌種類多，且具有廣譜性[9]。近年來，隨著模式作物序列的公布和分子生物學技術的發展，作物中抗病QTL的克隆取得很大研究進展，大量的QTL位點被克隆[10]。涉及到這些QTL位點的抗病基因僅成功克隆6個：Lr34[11]、Yr36[12]、Pi21[13]、Rcg1[14-15]、ZmWAK[16]和ZmCCT[17]，而且有關這些QTL位點的抗病基因分子作用機制缺乏報道。這些QTL抗病基因中，Pi21基因是一個對水稻稻瘟病具有廣譜抗性的QTL，表現出非小種特異的抗性[13]。FUKUOKA等[18]利用近等基因系材料定位并克隆Pi21基因。Pi21編碼一個富含脯氨酸的蛋白，該蛋白包含一個重金屬結合功能域和一個蛋白與蛋白互作功能域。小麥中，通過圖位克隆方法獲得的Lr34編碼一個類似ABC transporter的蛋白，對小麥葉銹病、小麥條銹病和小麥白粉病均有抗性[11,19]?？共』験r36控制著高溫條件下對小麥條銹病的廣譜抗性[12]。FU等[12]利用感病親本Langdon與遺傳背景相近的重組代換系雜交的分離群體對Yr36進行精細定位，并在此基礎上克隆Yr36，該基因編碼一個包含激酶功能域和START磷脂結合功能域的蛋白，這兩個結構域對小麥條銹病的抗病性具有重要作用。

鐘濤[20]和TAO等[21]采用連續精細定位方法，在玉米重組個體后代測定中精細定位一系列抗病QTL，如：抗粗縮病的qMrdd1、抗絲黑穗病的qHSR1、抗灰斑病的qRgls1和qRgls2，并克隆抗莖腐病和抗絲黑穗病的QTL。左為亮[22]利用重組個體后代測定的QTL連續精細定位和克隆檢測到一個抗絲黑穗病主效QTL，并通過轉基因功能互補鑒定證明該主效抗病QTL為ZmWAK基因。該基因編碼細胞壁相關激酶，在圍繞韌皮部的薄壁細胞中高表達，能夠激活水楊酸依賴的抗病響應基因，抑制病原菌的生長，從而達到最佳的抗病效果。

針對玉米禾谷鐮刀菌[23]、腫囊腐霉菌[24]、赤霉菌[25]等病原菌莖腐病，已經鑒定到一些QTLs，但由于研究采用的手段和群體有所差異，使得QTLs具有不同的遺傳特性[20]。SONG等[24]在抗腐霉莖腐病自交系齊319中定位并克隆抗腫囊腐霉菌莖腐病基因RpiQI319-1和RpiQI319-2。DUAN等[26]在抗病材料X178中將抗腫囊腐霉菌莖腐病顯性基因RpiX178-1精確定位到1號染色體分子標記SSRZ8和IDP2347之間。MA等[25]在抗病自交系H127R材料中將抗赤霉菌莖腐病QTL-qRfg3定位到3號染色體，物理距離精確到350 kb。

研究報道，Pè等[23]利用高抗莖腐病玉米自交系B87和高感莖腐病自交系33-16組配150個F2:3家系。接種禾谷鐮刀菌后對性狀進行鑒定和分析，定位到5個抗禾谷鐮刀菌莖腐病的QTL位點，分別位于第1號、第3號、第4號、第5號和第10號染色體上。JUNG等[27]將玉米抗炭疽莖腐病的主效QTL(Rcg1)定位到第4號染色體長臂上。WOLTERS等[15]克隆抗炭疽莖腐病的主效QTL-Rcg1。Rcg1是玉米抗炭疽莖腐病的一個主效QTL基因。該基因編碼一個典型的NBS-LRR類抗病基因蛋白，這一家族蛋白在病原菌識別、植物抗病反應過程中起重要作用[28-29]。YANG等[30]認為玉米對腫囊腐霉菌莖腐病的抗性受單基因Rpi1控制，并將其定位在第4號染色體分子標記bnlg1937和agrr286之間，遺傳距離為5.7cM。董五輩和王國英[31]利用高抗莖腐病自交系P138和高感莖腐病自交系5003組配F2:3家系，通過接種腫囊腐霉菌鑒定表型，同時檢測基因型，將抗病基因定位在第4號染色體分子標記bnlg490和umc1382之間，遺傳距離為4.1cM。

前期研究中，YANG等[30]將一個抗禾谷鐮刀菌莖腐病的單基因定位在第6號染色體分子標記mmc0241和bnl3.03之間，遺傳距離為5.0cM，他們將另一個抗禾谷鐮刀菌莖腐病主效QTL-qRfg1定位到bin10.04染色體500 kb區段內，可使抗性提高37.2%～54.4%[9,15,20]。他們將主效QTL-qRfg1位置縮短到170 kb范圍內，通過高密度遺傳圖譜分析和轉基因植物抗性鑒定等手段克隆到玉米抗莖腐病數量抗病基因ZmCCT。在ZmCCT轉基因T2代、T4代和T6代中，陽性植株田間抗性平均提高30%，具有明顯的抗莖腐病功能。他們利用以1145和Y331構建的回交群體(Y331為輪回親本)，對位于2號染色體上bin10.04位置的主效QTL-qRfg1進行精細定位。利用4 035株BC6F1群體(來自41個BC5F1交換單株)將qRfg1定位到約190 kb的區間內。此后，利用新開發的標記CCT11和SSR483在4 035株BC6F1群體中進一步篩選重組個體，找到位于定位區段內的2個新的重組類型，將qRfg1區段縮小到分子標記CCT11和SNP551之間，物理距離約為170 kb。通過多分子標記篩選BAC文庫，通過測序，序列比較和功能注釋，確定ZmCCT為QTL-qRfg1的候選基因，并克隆到抗禾谷鐮刀菌莖腐病基因ZmCCT[32]。

目前，有關玉米抗莖腐病基因ZmCCT的抗病作用機理尚不明確。已知ZmCCT基因編碼一個轉錄因子，定位于細胞核并含有保守的CCT功能域[9]。ZmCCT中含有的CCT保守域在玉米抗莖腐病過程中起重要作用。CCT結構域為植物所特有，CCT家族的基因是參與植物抗逆過程的重要基因。CCT結構域最早在擬南芥中被發現，其C端是由約43～45個氨基酸組成的結構域，該段氨基酸序列在CONSTANS，CONSTANS類基因和TIMING OF CAB1(TOC1)表現為高度保守，因此，它被命名為CCT結構域[33-35]。ZmCCT作為一個典型的CCT結構域因子，究竟如何響應抗病逆境信號，如何在轉錄水平上調控下游靶標基因來實現其生物學功能尚不清楚。進一步鑒定CCT保守結構域的功能，探究ZmCCT基因編碼產物參與抗病的分子機理，有助于全面解析ZmCCT基因的作用機制。本研究將進一步探究抗玉米莖腐病基因ZmCCT的功能，對ZmCCT基因的缺失區段進行載體構建及原核蛋白表達并在大腸桿菌中表達純化，為后續ZmCCT蛋白免疫抗體的制備和分子機理等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

玉米近等基因系Y331-△TE1是攜帶不含轉座子的抗病ZmCCT等位基因，玉米近等基因系Y331是攜帶含轉座子的感病ZmCCT等位基因，見圖1(Y331-△TE1和Y331來源于中國農業大學徐明良教授)。溫室培養(28 ℃，光照16 h；24 ℃，黑暗8 h)，待生長到三葉一心時采集植株地上部分，并將樣品液氮速凍，于-80 ℃保存備用。

pMD19-T載體和Rosetta(DE3)感受態細胞購自北京博邁德基因技術有限責任公司。PGEX-6P-1載體為北京農學院作物逆境生物學實驗室保存。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)和質粒小提試劑盒(DP103)購自天根生化科技(北京)有限公司。Prime Seript One-Step gDNA Removal、cDNA Synthesis SuperMix試劑盒、6×DNA loading buffer(G2525)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)溶液(I5005)和LAB2000 DNA Marker(L2000)均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1ZmCCT基因不同缺失區段的擴增與原核表達載體的構建 使用Trizol法提取玉米Y331-ΔTE1組織的總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄，獲得第一鏈cDNA，保存于-20 ℃，備用。

ZmCCT全長的正向引物為5′-TTGGATCCATGATGTCGTCGGGGCCAGCAGC-3′，反向引物為5′-TTCTCGAGTCATTCGGTTACCTTGGCAA-3′。根據NCBI網站GenBank上ZmCCT基因的序列(LOC103641424，圖2)，使用DNAMAN軟件設計4對克隆引物。4對克隆引物分別為ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540(表1)。以cDNA為模板分別用4對克隆引物進行擴增。

表1 引物序列Tab.1 DNA sequence for primer

對擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。膠回收試劑盒回收目的片段?；厥盏腄NA產物存放于-20 ℃，備用。

將回收DNA產物與pMD19-T(simple)載體進行連接。復蘇感受態細胞BMTOP10加入T載體反應連接液，震蕩培養1 h。將菌液接種到含氨芐西林抗性的LB固體培養基中，37 ℃過夜培養12～14 h。使用高純度質粒小量提取試劑盒(柱離心型)進行質粒提取，得到含有目的片段的質粒DNA。用限制性內切酶(BamHI、XhoI)對提取的質粒進行雙酶切驗證陽性克隆。將陽性DNA片段亞克隆到原核表達載體PGEX-6P-1中，16 ℃過夜連接。將連接產物轉化至TOP10感受態細胞中，37 ℃過夜培養。然后挑取單菌落并將其接種于LB液體培養基中(含100 g/mL的氨芐西林)過夜培養，菌落PCR驗證陽性，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

1.2.2ZmCCT缺失區段原核表達載體的誘導表達與鑒定 將鑒定為克隆陽性的PGEX-6P-1-ZmCCT1-300、PGEX-6P-1-ZmCCT300-540、PGEX-6P-1-ZmCCT1-540和PGEX-6P-1-ZmCCT540-717質粒轉化到Rosetta中，37 ℃過夜培養。挑取單株菌落。再接種于LB液體培養基(100 μg/mL的氨芐西林)中，過夜振蕩培養。轉接到3 mL LB液體培養基(100 μg/mL的氨芐西林)中，37 ℃振蕩培養約1 h。菌液OD600值為0.6時，加入0.4 mmol/L的IPTG，16 ℃培養誘導3 h，離心，棄上清，收集沉淀，沉淀使用1×PBS重懸，并加入1×loading buffer，100 ℃金屬浴加熱12 min，使蛋白變性。經高溫變性后的樣品4 ℃、12 000 r/min離心3 min。將誘導菌株PGEX-6P-1-ZmCCT和未誘導的陰性對照，進行SDS-PAGE電泳檢測，對重組菌表達及可溶性情況進行初步鑒定。

分別挑選2個生長較好的單株菌落，接種至2 mL LB液體培養基(100 μg/mL的氨芐西林)中，于搖床(37 ℃，220 r/min)中培養12～14 h；將400 μL培養液接種于帶有氨芐西林的LB液體培養基內(每組2管)，搖床37 ℃，220 r/min培養至OD600值為0.6。選取一組加入6 μL終濃度為0.4 mmol/L誘導劑IPTG。另一組不加誘導劑IPTG作為陰性對照，搖床37 ℃，220 r/min培養3 h。將1.5 mL培養液加入離心管內，12 000 r/min離心3 min收集沉淀；在1.5 mL培養液的沉淀中加入15 μL的10×loading buffer和20 μL的ddH2O混勻，100 ℃變性處理使其充分混合，重懸后取8 μL重懸液上樣進行SDS-PAGE電泳(120 V恒壓，1.5 h)；使用考馬斯亮藍染色1 h，脫色后鑒定。

1.2.3 PGEX-6P-1-ZmCCT表達產物的純化 在0.01～5.00 mmol/L的范圍內改變誘導劑IPTG濃度，在誘導的不同時間測定OD600值。依據SDS-PAGE分析，確定終濃度為0.4 mmol/L的誘導劑IPTG，過夜培養8 h為最佳誘導表達條件。吸取12～14 mL菌液至1 000 mL LB液體培養基中，培養至OD600值為0.6。加入誘導劑IPTG誘導表達，過夜培養8 h。離心，收集沉淀，加入裂解緩沖液充分懸浮菌體沉淀。超聲處理破碎細胞后離心(4 ℃ 12 000 r/min，15 min)，取上清，并吸取1 mL作為對照。用裂解緩沖液平衡鎳柱約30 mL，加入40 μL載體標簽對應的親和層析珠，充分結合4 h。洗脫收集蛋白純化液體，通過SDS-PAGE電泳檢測，觀察純化結果。

2 結果與分析

2.1 ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540 片段的構建

ZmCCT中約582～714 bp位置含有一個保守CCT結構域。將ZmCCT基因分為3個缺失區段，然后構建4個缺失突變體ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT1-540和ZmCCT540-717，見圖3。

2.2 ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540 缺失區段PCR產物片段的獲得

PCR擴增得到ZmCCT基因的缺失區段。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，ZmCCT1-300、ZmCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540分別在約300、240、177和540 bp處呈現特異性條帶，且與預期的條帶大小吻合，見圖4。

2.3 pMD19-T載體重組質粒的鑒定

將ZmCCT片段插入pMD19-T載體并轉化至感受態細胞TOP10中，過夜培養單克隆菌落并提取重組質粒，雙酶切鑒定后進行凝膠電泳分析，在預期位置出現大小合適的目的片段(圖5，圖中雜帶為引物非特異性擴增)，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化回收。

2.4 PGEX-6P-1載體重組質粒的雙酶切與測序鑒定

連接pMD19-T載體回收后的片段插入到PGEX-6P-1表達載體后，經雙酶切鑒定和測序鑒定，在預期位置出現大小合適的DNA目的條帶(圖6，圖中雜帶為引物非特異性擴增)。同時，將條帶正確的克隆進行DNA測序，發現DNA序列完全正確，未出現點突變。

2.5 ZmCCT 基因在原核表達載體中的表達及可溶性分析

將PGEX-6P-1-ZmCCT重組質粒轉化至Rosetta(DE3)宿主菌，挑取菌落進行蛋白誘導表達小量檢測，當加入誘導劑IPTG誘導表達時，ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540均有明顯蛋白富集，而未誘導宿主菌未見明顯表達(圖7)。將已經表達的菌液按照菌液∶甘油=3∶2的比例保存于-80 ℃，用于蛋白純化。

2.6 ZmCCT 基因表達蛋白的純化

親和層析純化重組蛋白，將超聲前的上清、不同批次的洗脫液、結合后的流穿液分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。流經鎳柱后，重組蛋白均結合到表達載體對應標簽的親和層析珠上，洗脫后獲得大小相符的目的條帶，盡管有雜帶出現，但在對應大小處有大量蛋白富集。成功獲得ZmCCT1-300、ZmCCT300-540和ZmCCT1-540三段表達符合預期的蛋白(圖8)。

3 討 論

玉米莖腐病發病常導致玉米莖稈變黃直至枯萎，是嚴重危害玉米生產的土傳真菌病害。近年來，隨著模式作物序列的公布和分子生物學技術的發展，盡管作物中抗病QTL的克隆取得很大進展，但是，由于植物數量抗病基因的復雜性，迄今為止，僅有為數不多的QTL抗病基因被克隆到。ZmCCT基因作為目前僅有的抗禾谷鐮刀菌莖腐病基因被克隆，WANG等[32]和KU等[33]研究ZmCCT基因一個近130 kb的QTL序列區段上編碼一個假基因、一個CCT結構域轉錄因子和兩個轉座因子，轉座子TE1的插入導致ZmCCT功能發生變化，當TE1插入時，玉米抗禾谷鐮刀菌的抗性減弱。

CCT結構域為植物所特有，在編碼開花相關基因的蛋白中被發現，是典型的一因多效基因，參與植物調控光周期開花、光信號傳導、晝夜節律調節和植物生長等過程[34]。CONSTANS蛋白中包含兩個高度相似的B-Box結構域，B-Box結構域中有7個保守的殘基使得CCT結構域高度保守[35]。在本研究中，ZmCCT1-300、ZmCCT300-540和ZmCCT1-540三個缺失區段在對應蛋白大小處出現明顯的條帶，經鎳柱純化后，獲得高純度的重組融合蛋白。CCT結構域大約位于ZmCCT基因的580 bp到714 bp的位置上，雖然成功構建僅包含CCT結構域的蛋白表達載體，但是未成功純化出原核蛋白?？赡苁怯捎贑CT的特殊結構導致的，CCT結構域編碼的蛋白屬于鋅指蛋白超家族，鋅指蛋白的三維結構十分復雜，這可能是ZmCCT540-717未成功純化的原因之一[27]。還有可能是ZmCCT540-717沒有進行原核蛋白表達，后期準備嘗試用真核表達載體進行純化ZmCCT540-717區段蛋白。

此外，ZmCCT不僅在抗玉米禾谷鐮刀菌抗性中起到非常重要的作用，同時還受到光周期的調節從而影響玉米的花期[18]。ZmCCT所在的位置是許多重要農藝性狀QTL定位的熱點位置，可能是其他逆境脅迫響應的熱點。ZmCCT啟動子中TE1轉座子也是降低光周期敏感性的突變位點。ZmCCT究竟如何參與逆境脅迫的信號響應？以及ZmCCT如何作為轉錄因子協同其他互作蛋白去調控下游的靶標基因？這些問題有待于進一步研究。該研究為進一步探究ZmCCT的功能，后續免疫蛋白抗體的制備以及下游靶標基因的尋找等分子機理奠定基礎。