新疆密點麻蜥mtDNA Cytb基因系統進化分析

鐘 文，李 鈾，2，韓 晨，謝 慧，陳偉基*

（1．西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030；2．西北民族大學生物醫學研究中心甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅蘭州730030）

麻蜥亞屬（Eremias）是為區分蜥蜴亞屬（Lacerta）而建立的，在指定敏麻蜥（Eremias arguta）為麻蜥屬的模式種后，亞屬被提升為屬，并入Eremiae科[1]。全世界有麻蜥50余種，廣泛分布于亞洲、歐洲、非洲的溫帶和暖溫帶[2]。趙爾宓等[3]在2000年校正過中國兩棲綱（Amphibian）和爬行綱（Reptilia）動物名錄，認為國內麻蜥有9種，主要分布于東北、西北和華北。密點麻蜥（Eremias multiocellata）是我國荒漠草原和半荒漠草原最常見的卵胎生蜥蜴，在生態系統中屬于消費者，保證能量遵循食物鏈和食物網逐級流動，在荒漠化草原生態系統中起著舉足輕重的作用[4]。因此，對密點麻蜥群體進行系統進化分析，對后續合理利用及種質資源保護工作有重要意義。

遺傳多樣性是生物進化和適應環境的基礎，種群遺傳多樣性的缺乏對該物種的生存是巨大的威脅[5]。線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是動物細胞唯一一種核外遺傳物質，因分子量小、進化速率快、無重組、母系遺傳等特性，是研究親緣物種遺傳關系及起源進化的理想分子標記[6]。線粒體基因組中共有37基因，有13個蛋白編碼基因，其中細胞色素b基因（Cytochrome b，Cytb）因結構和功能較為清楚，所以被廣泛應用于物種鑒定、分子進化、系統地理學和遺傳結構研究[5,7]。近年來對密點麻蜥的研究越來越多，如食性[8]、環境[9-10]、兩性異型及繁殖[1]、分子方面[11-12]等，但在Cytb基因上對于密點麻蜥的研究不多。因此，本研究利用Cytb基因，對密點麻蜥進行系統發育分析，并探討與國內的幾種麻蜥的遺傳關系，補充和豐富新疆地區密點麻蜥的基礎遺傳數據，為保護該地區內其他物種提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究的密點麻蜥樣品采自新疆維吾爾自治區南部的5個地區，具體樣品信息及從Genbank上獲取的樣品序列號見表1。

表1 樣品信息及Genbank序列號Tab.1 Sample information and GenBank serial number

1.2 基因組DNA提取

使用通用型基因組DNA提取試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）進行基因組DNA的提取，并放置于-20℃冰柜保存，備用。

1.3 引物設計與PCR擴增

根據Genbank公布的密點麻蜥線粒體DNA全序列（序列號為KM257724.1），使用軟件Primer Premier 5.0[13]進行引物設計，上游引物：CytbF（5'-ACATACGAAAA CAACATCCAATCT-3'），下游引物：CytbR（5'-TTATTTTCTAGGGTGGCGGCT-3'）。引物由寶生物工程（大連）公司合成。

使用設計的引物對本次密點麻蜥樣本進行線粒體Cytb基因的擴增。通過試驗，建立的最佳PCR擴增體系（25μL）：2×Pro Taq Master Mix（dye plus）12.5μL、5μmol/L上下游引物0.5μL、密點麻蜥基因組DNA 2μL、ddH2O 9.5μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共循環35次；72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物經1.4%瓊脂糖凝膠電泳進行純度檢測。檢測合格的擴增產物由蘭州天啟基因生物科技有限公司進行測序。

1.4 數據統計與分析

采用Geneious 2020.2.5（http://www.geneious.com）處理測序結果原始ABI文件，經過人工校對后獲得18條密點麻蜥Cytb基因樣本序列。下載Genbank上已發表的38條中國麻蜥[荒漠麻蜥（Eremias przewalskii）、天山麻蜥（Eremias stummeri）、麗斑麻蜥（Eremias argus）、蟲紋麻蜥（Eremias vermiculata）、快步麻蜥（Eremias velox）、山地麻蜥（Eremias brenchleyi）]序列及2條南疆沙蜥序列作為外群的物種序列，見表2。

表2 物種名稱及Genbank序列號Tab.2 Species name and GenBank serial number

續表2 物種名稱及Genbank序列號Tab.2 Species name and GenBank serial number

將所得密點麻蜥Cytb基因序列與下載的40條蜥蜴序列用MEGA-X[14]進行對比，然后采用鄰接和最大似然法分別構建系統進化樹進行系統發育分析。NJ法與ML法構建的進化樹Bootstrap置信值均為重復抽樣1 000次。

2 結果與分析

2.1 Cytb基因測序結果

各個樣品最終序列均在1 000～1 200 bp之間，測序結果經軟件Geneious 2020.2.5拼接并人工校對后獲得Cytb基因，長度為989 bp。

2.2 Cytb基因密點麻蜥的系統發育分析（見圖1、圖2）

圖1 NJ系統發育樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree

圖2 ML系統發育樹Fig.2 Maximum Likelihood phylogenetic tree

利用MEGA-X軟件，應用鄰接法（NJ）構建了密點麻蜥與其他麻蜥Cytb基因的NJ進化樹，進化樹Bootstrap置信值為重復抽樣1 000次。

由圖1可知，從種群間看，5個地區18個密點麻蜥樣本均在同一分支，每個地區樣本幾乎均是獨立分支，喀什地區的密點麻蜥與同市葉城和塔什庫爾干的密點麻蜥親緣關系最近，但喀什地區的M13稍有偏離，與烏恰的密點麻蜥屬于同一分支。從品種間看，密點麻蜥與其余6種麻蜥在同一分支上，其中與荒漠麻蜥的親緣關系最近，天山麻蜥次之，親緣關系最遠的是山地麻蜥。南疆沙蜥作為外群，獨立于另一分支上。

圖2是基于Cytb基因運用MEGA-X軟件中的MODELS功能，通過計算找到此次最大似然法構建進化樹的最佳模型為Hasegawa-Kishino-Yano，而構建成的ML進化樹，該進化樹Bootstrap置信值為重復抽樣1 000次。

由圖2可知，結果與NJ進化樹的結果基本一致，南疆沙蜥獨立于1個分支，所有麻蜥在1個分支上，其中與山地麻蜥的親緣關系最遠，荒漠麻蜥的親緣關系最近。密點麻蜥種群間每個地區樣本幾乎都是獨立分支，喀什地區的密點麻蜥與民豐的密點麻蜥親緣關系最遠，烏恰次之，與同市葉城和塔什庫爾干的密點麻蜥親緣關系最近。但是，喀什地區的M13稍有偏離，與烏恰的密點麻蜥屬于同一分支。

3 討論

遺傳多樣性是物種長期進化或群體持續生存并適應不斷變化環境而進化的結果，物種遺傳多樣性或變異性越豐富，表明物種的進化潛力越大，對環境改變適應的進化能力越強[15]。研究物種遺傳多樣性對于評估物種資源狀況，制定野生物種資源保護策略等方面具有重要意義[5]。線粒體Cytb基因具有較高的進化速率，是研究種間遺傳多樣性和系統發育關系的主要分子標記之一。

本研究基于Cytb基因采用鄰接法（NJ）和最大似然法（ML）構建的兩種進化樹結果幾乎一致，通過分析可知，首先，在密點麻蜥種群中，5個地區共計18個樣本均在1個分支上，喀什地區的密點麻蜥與同市的葉城和塔什庫爾干的密點麻蜥親緣關系最近，烏恰親緣關系次之，與民豐地區的親緣關系最遠。每個地區的樣本幾乎單獨在1個小分支上，但是喀什地區的M13樣本被分到烏恰地區的分支上，表明這兩個地區的密點麻蜥可能存在基因交流。第二，從品種間看，密點麻蜥與所有麻蜥在1個大分支上，其中與密點麻蜥親緣關系最遠的是山地麻蜥，而后依次為快步麻蜥、蟲紋麻蜥、麗斑麻蜥和天山麻蜥，荒漠麻蜥則是與其親緣關系最近的品種。本研究與前人的研究結果相似，以往研究表明，雖然兩種蜥蜴的形態學差異很大，但密點麻蜥與荒漠麻蜥的遺傳距離很小，甚至低于亞種水平[2,12]。南疆沙蜥區別于所有麻蜥，單獨占據1個大分支，雖然其與密點麻蜥不同屬，遺傳距離也最遠，但其之間是否存在基因交流的個例無法確定，有待進一步研究。

4 結論

本研究對新疆南部5個地區密點麻蜥的線粒體基因Cytb進行擴增測序，基于Cytb基因與中國6種麻蜥和南疆沙蜥構建系統進化樹，發現密點麻蜥種群間存在基因交流，密點麻蜥和荒漠麻蜥間可能存在基因流動，即可能存在雜交現象，但目前的數據無法證明這一點。本研究補充和豐富了新疆部分地區密點麻蜥的基礎遺傳數據，為后續合理利用及保護該地區內其他物種的種質資源奠定基礎。