基于轉錄組學的巨菌草內生鏈霉菌拮抗玉蜀黍平臍蠕孢的分子機理

黃在興, 宋昭昭, 梅 蘭, 李 曼, 劉朋虎, 蘇德偉, 林占熺, 魯國東,2

(1.福建農林大學國家菌草工程技術研究中心；2.福建農林大學植物保護學院，福建 福州 350002)

巨菌草(Pennisetumgiganteumz.x.lin)屬于禾本科狼尾草屬多年生植物，為典型的碳四植物，其分蘗速度快、根系發達、生物量大、營養豐富、適口性好、內生菌豐富[1-2].因此，巨菌草不僅被廣泛應用于栽培食藥用菌，制作青貯飼料、微生物菌肥，還被用于發電、崩崗和沙漠生態環境治理、生產沼氣和乙醇及造紙等領域[3].

玉蜀黍平臍蠕孢(Bipolarismaydis)是玉米小斑病的致病菌，會對玉米生產造成嚴重損失[4].近年來，玉米小斑病在我國大部分地區均有發生，輕則降低千粒重，重則導致果穗腐爛、種子發黑、發芽率降低，嚴重影響玉米的產量和品質[5-6].目前，對玉米小斑病的防治主要采用化學藥劑和選育抗病品種等手段，但病原菌容易產生變異，防治效果不理想[4].為了解決糧食生產和環境安全問題，實現農業可持續發展，采用內生菌拮抗玉蜀黍平臍蠕孢成為防治玉米小斑病的一個重要研究方向.內生菌可以作為生防菌，防治多種病害，植物內生真菌的防病作用機制主要包括分泌抗菌物質、與病原物競爭營養和生態位、誘導植物抗性等.

本課題組前期已證實巨菌草內生鏈霉菌(Streptomycessp.)對玉蜀黍平臍蠕孢有較好的拮抗作用[7]，但具體的作用機制尚不明確.因此，本研究采用RNA-seq對玉蜀黍平臍蠕孢在鏈霉菌發酵液脅迫和無發酵液條件下的轉錄組進行測序，對表達差異基因進行Gene Ontology(簡稱GO)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，結合表達量和表達倍數的差異以及關鍵途徑，挖掘關鍵基因，分析巨菌草內生鏈霉菌拮抗玉蜀黍平臍蠕孢的機制，為今后玉米小斑病的生物防治奠定理論基礎，同時為巨菌草內生鏈霉菌的抗菌機制的研究提供基礎數據.

1 材料與方法

1.1 材料

巨菌草內生鏈霉菌由福建農林大學國家菌草工程技術研究中心從巨菌草健康葉片中分離保存，采用改良高氏一號培養基傳代培養，28 ℃培養5 d.

玉蜀黍平臍蠕孢由福建農林大學國家菌草工程技術研究中心分離保存，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基傳代培養，28 ℃培養3 d.

1.2 方法

1.2.1 內生鏈霉菌發酵液的制備 將內生鏈霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖水(PDB)培養基中，28 ℃、180 r·min-1條件下培養5 d.使用旋轉蒸發儀濃縮內生鏈霉菌發酵液，旋轉瓶內每次添加發酵液約瓶容積的1/3，壓強0.09 MPa，溫度55 ℃，將內生鏈霉菌發酵液300 mL減壓蒸餾濃縮至10 mL.用0.22 μm無菌過濾器對發酵液進行過濾消毒，4 ℃冰箱避光保存.

1.2.2 內生鏈霉菌發酵液脅迫處理 將病原菌接種于100 mL PDB培養基中，每瓶加入2 mL滅菌的鏈霉菌發酵液(S組).以沒加發酵液的培養基為對照(CK組)，每組3個重復.28 ℃、180 r·min-1條件下培養3 d.無菌條件下收集菌絲后立刻采用液氮速凍，后保存于-80 ℃冰箱.

1.2.3 RNA提取與反轉錄 使用Omege soil RNA Kit提取總RNA，分別通過Nanodrop和Agilent 2100檢測RNA純度(D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm)及RNA片段長度.RNA樣品檢測合格后用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，隨后以mRNA為模板，用六堿基隨機引物進行反轉錄,合成cDNA.

1.2.4 cDNA文庫構建 利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA，然后進行末端修復、加A、加接頭.再通過AMPure XP beads選擇雙鏈cDNA片段大小，最后進行PCR擴增以構建cDNA文庫.每個處理取3個生物學重復的RNA樣品進行混合，用于RNA-Seq轉錄組測序.

1.2.5 測序片段的組裝與功能注釋 利用Illumina HiSeq 4000高通量測序平臺對文庫進行轉錄組測序.下機數據(raw data)一般含有少量低質量的reads，會對后面分析造成影響，所以去除帶有測序接頭(adapter)、N(不確定堿基)含量≥10%和低質量堿基(Q≤20)含量大于50%的reads.用Tophat2軟件比對測序序列和轉錄組參考序列，隨后利用Cufflinks軟件組裝比對結果[8]，對測序結果進行RNA-Seq相關性檢查.采用HTSeq軟件分析各樣品的基因表達水平(以FPKM=1作為判斷基因是否表達的閾值，只分析FPKM>1的基因)，并使用DESeq分析差異表達基因(差異基因篩選的標準為q<0.05)[9-10].通過GOseq軟件對差異表達基因進行GO富集分析，將測序結果與KEGG數據庫比對以分析其Pathway顯著性，并對差異表達基因進行功能注釋和分類[11].

1.2.6 qRT-PCR驗證 通過兩個樣本轉錄組測定與KEGG通路查找，隨機分析氨基酸生物合成、RNA轉運等通路中5個差異表達基因的表達情況，利用相對定量qRT-PCR驗證結果.用Primer 5軟件設計引物(引物見表1).將各RNA樣品采用第一鏈cDNA合成試劑盒反轉錄為cDNA，以反轉錄產物為模板、18S rRNA基因為內參基因，采用全式金公司的SYBR Green RT-PCR試劑盒，通過CFX ConnectTMOptics module qPCR系統(美國Bio-Rad公司)對各基因進行熒光定量檢測.反應體系為20 μL：正、反引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，2×TaqRT-PCRMix 10 μL，ddH2O 8 μL.擴增程序：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，40個循環，72 ℃最終延伸5 min.各樣品中每個基因重復3次.按2-ΔΔCt定量計算相對表達量[12].

表1 實時熒光定量PCR所用的引物Table 1 Primers used in real-time quantitative PCR

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序數據分析

高通量測序共測得133 060 305個raw read pairs，經過質控，得到128 613 786個clean read pairs.從12個樣本中均獲得了至少2.8 G容量的原始數據，堿基GC含量都在54%左右，錯誤率指標Q20和Q30分別在95%和90%以上(表2).這說明轉錄組測序所獲數據的質量較好，可用于后續分析.

表2 兩組樣品測序數據及質量檢驗1)Table 2 Sequencing data and quality test of 2 groups of samples

樣品之間表達模式的相似度越高，相關系數(R2)就越接近1.由表3看出，CK與S間的相關系數在0.974左右，說明結果可靠且樣本選擇合理.

表3 兩組樣品間的相關系數Table 3 Correlation coefficients between 2 groups of samples

將轉錄組測序數據與選擇的參考基因組進行比對分析，結果如表4所示.兩組樣品轉錄組測序獲得的序列，能定位到基因組上的序列片段有200 121 858 bp，占比76.81%～78.93%；參考序列上有多個比對位置的序列片段有6 691 576 bp，占比2.39%～2.92%；參考序列上有唯一比對位置的序列片段有193 430 282 bp，占比74.08%～76.53%；比對到基因組上正鏈和負鏈的序列片段均有96 715 141 bp，占比均為37.04%～38.27%.能定位到基因組上的序列片段中，分段比對到兩個外顯子上的序列片段有36 371 164 bp，占比13.90%～14.42%；整段比對到外顯子上的序列片段有157 059 118 bp，占比60.08%～62.12%.結果說明所選取的參考基因組合適.

表4 測序數據與參考基因組比對Table 4 Comparison on sequencing data and reference genome

2.2 差異表達基因篩選

S組和CK組比較，共篩選出4 559個差異表達基因.其中，S組相對于CK組上調基因2 276個(圖1)，占總差異表達基因數的49.9%；下調基因2 283個，占總差異表達基因數的50.1%.上調基因和下調基因數量相當，說明內生鏈霉菌發酵液對玉蜀黍平臍蠕孢相關基因表達有顯著的影響.

圖1 差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano diagram of differentially expressed genes

2.3 差異表達基因功能注釋

2.3.1 GO富集分析 結果顯示，共有2 605個差異表達基因被富集到1 976個GO term.對富集最顯著的30個GO term作圖(圖2)，可以看出在細胞組分(cellular component)類別中，富集到細胞(cell)、細胞內部分(cell part)、細胞成分組織 (cellular component organization)等的差異表達基因較多；生物過程(biological process)類別中，富集到細胞蛋白代謝(cellular protein metabolic process)、細胞通訊(cell communication)、信號轉導(signal transduction)等的差異基因較多；分子功能(molecular function)類別中，富集到核酸結合(nucleic acid binding)、核苷酸結合(nucleotide binding)、基質特異性透膜運輸活性(substrate specific transmembrane transporter activity)、底物特異性轉運體活性(substrate specific transporter activity)、跨膜轉運體活性(transmembrane transporter activity)等的差異基因較多.

*代表顯著富集的GO.圖2 差異基因的GO富集柱狀圖Fig.2 GO functional classification of differentially expressed genes

2.3.2 KEGG富集分析 玉蜀黍平臍蠕孢CK組和S組差異表達基因中共有456個基因被注釋到105條KEGG代謝通路中.圖3顯示了20條富集最顯著的通路，主要是次生代謝產物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)，氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)，酵母促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號途徑(MAPK signaling pathway-yeast)，抗生素的生物合成(biosynthesis of antibiotics)，嘌呤代謝(purine metabolism)，氨酰-tRNA的生物合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)，RNA轉運(RNA transport)，賴氨酸的生物合成(lysine biosynthesis)，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)，內吞作用(endocytosis)，維生素B6代謝(vitamin B6 metabolism)等.這些通路大多與玉蜀黍平臍蠕孢生長代謝及其對環境的應激適應相關.

圖3 差異表達基因的KEGG功能歸類Fig.3 KEGG functional classification of differentially expressed genes

2.4 關鍵基因的確定及其功能描述

在差異表達基因中，選擇表達量高且表達倍數差異顯著的基因(read count>20，至少在一個樣品中FPKM≥50)，結合代謝通路，確定了22個擬關鍵基因(表5)，絕大部分為假定蛋白，主要涉及多個氨基酸的生物合成和代謝.8個涉及氨基酸的合成和降解(其中僅有1個基因表達下調)，6個涉及抗生素的合成；gene9313和gene5020涉及RNA運輸，gene1147則與氨酰-tRNA的合成有關；下調表達的關鍵基因主要編碼糖苷水解酶與糖基轉移酶.此外，本研究還發現一個未被注釋到的新基因，編號為Novel00002，其read count在S組中達20 981個，為對照組的8.55倍，推測其在玉蜀黍平臍蠕孢響應內生鏈霉菌發酵液中具有重要的作用，值得更深入的研究.

表5 關鍵基因功能歸類Table 5 Function classification of key genes

2.5 差異表達基因的qRCR驗證

由圖4可以看出，5個基因的表達趨勢盡管有些差異，但qPCR檢測結果與轉錄組統計結果基本一致，說明轉錄組測序數據較為可靠.

圖4 5個差異表達基因的qPCR驗證Fig.4 qPCR verification of 5 differentially expressed genes

3 討論

鏈霉菌屬能夠產生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，抑制植物多種病原真菌，在植物病害的生物防治中發揮著積極的作用[13-14].本研究對玉米小斑病病原菌玉蜀黍平臍蠕孢在巨菌草內生鏈霉菌發酵液脅迫和無發酵液條件下的轉錄組進行測序分析，發現4 559個差異表達的基因，其中試驗組相對于對照組上調基因2 276個，下調基因2 283個，差異表達基因大部分涉及氨基酸生物合成、酵母MAPK信號通路、嘌呤代謝等通路，與信號轉導、細胞蛋白質代謝過程、細胞交流等生物過程相關.在GO富集中，富集到細胞組分的差異基因數量明顯多于富集到生物過程和分子功能的數量，這表明巨菌草內生鏈霉菌發酵液對玉蜀黍平臍蠕孢細胞相關基因的影響較大.有研究發現，青霉TS67菌株的發酵液和蒼白桿菌屬細菌YB01的培養液通過影響細胞壁、濃縮原生質體和細胞質抑制玉蜀黍平臍蠕孢菌的生長[15-16]；鏈霉菌屬StreptomycesphilanthiRM-1-13產生的揮發性物質能夠通過破壞立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)PTRRC-9的細胞壁達到抑菌效果[17].本試驗中，巨菌草內生鏈霉菌菌株也可能存在相似的作用機理.

蛋白質是組成生命體的重要成分，是維持機體生長和發育的關鍵物質基礎，而氨基酸是大分子蛋白質的基本組成單位，又是許多重要代謝途徑的重要中間體，機體對蛋白質的需求本質上是對氨基酸的需求[18-19].鏈霉菌屬是產抗生素的最大一類屬[20]，Svidritskiy et al[21]從產色鏈霉菌(S.griseochromogenes)培養液中提取的抗生素能夠作用于稻瘟菌的核糖體，干擾核糖體肽鍵的形成，使稻瘟菌的蛋白質合成受阻，從而抑制稻瘟菌的孢子萌發和菌絲生長.本研究中，在氨基酸生物合成通路中82個基因對發酵液脅迫具有響應，占比69.5%，其中78個基因上調表達，僅4個下調表達；挑選出的22個擬關鍵基因中，上調表達的關鍵基因主要涉及多種氨基酸的生物合成與代謝，而下調表達的關鍵基因主要編碼糖苷水解酶蛋白家族和糖基轉移酶蛋白家族.糖基轉移酶的主要功能是催化生物體內的活性糖與不同受體連接，以形成各種生物學功能的糖基化產物[22].由此推測玉蜀黍平臍蠕孢可能通過激活氨基酸生物合成途徑相關基因和減少糖苷分解的方式來響應內生鏈霉菌發酵液的脅迫，同時，內生鏈霉菌發酵液可能通過干擾玉蜀黍平臍蠕孢的氨基酸合成而實現抑制作用.有學者認為，低濃度抗真菌活性物質會引起病原真菌的代償性應激反應，通過激活相關信號通路基因緩解外源物對自身的毒害[23].本研究結果顯示，氨基酸相關通路的基因絕大部分表達上調，說明玉蜀黍平臍蠕孢也存在代償性應激反應.

MAPK信號通路中有43個基因對發酵液脅迫具有響應，占比75.4%，其中37個下調表達，僅6個上調表達，這說明內生鏈霉菌發酵液對玉蜀黍平臍蠕孢MAPK信號通路的影響較大.MAPK級聯途徑是真核生物中普遍存在的信號轉導模式，可參與調控真菌的菌絲生長和致病性等多種生命過程，并在不同的過程中均發揮著至關重要的作用[24].本課題組前期證實巨菌草內生鏈霉菌菌株的發酵液能夠有效抑制玉蜀黍平臍蠕孢的菌絲生長[7]，因此，推測內生鏈霉菌發酵液通過調控MAPK信號通路相關基因的表達而抑制菌絲生長.

從研究結果來看，玉蜀黍平臍蠕孢眾多基因對內生鏈霉菌發酵液的脅迫有不同程度的響應，說明不同基因對脅迫響應的調節方式不同，但關鍵基因涉及的途徑或功能相對集中.今后可從發酵產物的分離鑒定，發酵液脅迫對病原菌形態、細胞結構的影響，關鍵基因全長克隆和功能驗證等方面進行更深入的研究.