SIX1、E-cad在子宮內膜增生性病變組織中的表達及意義

朱惠萍 王麗丹

浙江省諸暨市人民醫院(311800)

子宮內膜增生中部分病變屬子宮內膜癌的癌前病變[1]。子宮內膜增生主要臨床特點是月經周期紊亂、不規則陰道流血，降低女性生育能力[2]。尋找子宮內膜增生性病變相關因子，探尋其發病機制，進而制定有效治療方案，可能對降低癌癥發生有重要意義。同源盒基因SIX1是一種多基因家族的轉錄調節因子，與惡性腫瘤的發生發展關系密切[3]。上皮型黏附素(E-cad)是一類介導同質細胞間黏附的跨膜糖蛋白，對腫瘤的發生、發展、浸潤等有重要作用[4]。SIX1、E-cad在子宮內膜增生性病變中的作用有待探究。因此，本研究通過探究單純性增生患者、復雜性增生伴非典型增生患者內膜組織中SIX1 mRNA、E-cad mRNA及蛋白表達水平，以期為子宮內膜增生性病變發病機制研究及阻止癌變發生提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年12月-2021年3月本院行刮宮術的子宮內膜增生性病變內膜組織159例標本，患者均因不規則陰道流血就診。納入標準：①子宮內膜增生性病變患者均符合相關診斷標準[5]，且經術后病理證實；②術前3個月內未接受化療、放療、激素類藥物治療；③臨床資料完整且自愿參加本研究，研究符合倫理學標準；④無肝臟疾病及其他器官惡性腫瘤者。排除標準：①存在嚴重內科疾病及免疫代謝性疾??；②生殖器官發育畸形；③妊娠期或哺乳期婦女。本研究經本院倫理委員會審批。

1.2 主要試劑與儀器

總RNA提取試劑盒購自北京天漠科技開發有限公司；通用反轉錄試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自日本Takara公司；Rox reference dye購自武漢純度生物科技有限公司；免疫組化試劑盒購自德國Roche公司；SIX1抗體購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；E-cad抗體購自上海信裕生物科技有限公司。qRT-PCR儀(型號：ABI 7700)購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 檢測方法

1.3.1樣品采集及保存采集單純性增生患者、復雜性增生伴非典型增生患者行刮宮術時的組織標本，子宮內膜癌患者手術時取正常子宮內膜組織后立即相應處理，保存備用。

1.3.2內膜組織SIX1、E-cad mRNA水平檢測采用RNA提取試劑盒提取內膜組織總RNA后反轉錄得cDNA。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀擴增目的基因SIX1、E-cad和內參GAPDH。反應條件：95℃ 5 min；94℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環。反應體系：cDNA模板(50 ng/μl)1 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μl，Rox reference dye(50×)0.2 μl，ddH2O 3.0 μl，上下游引物(10 μM)各0.4 μl，引物序列見表1。樣品重復3次，采用2-△△CT法對受試者內膜組織中SIX1、E-cad mRNA水平進行相對定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3內膜組織SIX1、E-cad蛋白表達檢測3組內膜組織標本常規10%甲醛固定，梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片，采用免疫組織化學法檢測內膜組織SIX1、E-cad蛋白表達情況。依據免疫組化試劑盒說明操作(一抗為SIX1、E-cad抗體)，對組織切片進行染色，以陽性細胞百分數和著色強度評分：以著色強度計分，強著色3分，中等著色2分，弱著色1分，無著色0分；按照陽性細胞百分數計分，陽性細胞>76% 4分，51%～75% 3分，26%～50% 2分，6%～25% 1分，≤5% 0分。兩者相加為最終評分，總分≤3分為陰性(-)，>3分為陽性(+)，以蛋白表達陽性率作為最終統計標準。每張切片分別由2名病理科醫師判讀。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 納入對象基本情況

159例中，單純性增生(單純增生組)81例，年齡(55.9±8.7)歲(42～70歲)；復雜性增生伴非典型增生(復雜增生組)78例，年齡(56.4±8.9)歲(43～71歲)。同期子宮內膜癌患者83例正常子宮內膜組織(經病理學證實)內膜癌組，年齡(56.1±9.0)歲(42～71歲)。3組患者年齡無差異(P>0.05)。

2.2 SIX1、E-cad mRNA水平比較

SIX1 mRNA水平，復雜增生組最高、單純增生組次之、內膜癌組最低，E-cad mRNA水平復雜增生組最低、單純增生組次之、內膜癌組最高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組SIX1、E-cad mRNA水平比較

2.3 SIX1、E-cad蛋白表達比較

SIX1蛋白表達陽性率復雜增生組最高、單純增生組次之、內膜癌組最低，E-cad蛋白表達陽性率復雜增生組最低、單純增生組次之、內膜癌組最高(P<0.05)。見表3、圖1、圖2(1309頁)。

表3 各組SIX1、E-cad蛋白表達情況比較[例(%)]

圖1 內膜組織ＳＩＸ１免疫組織化學染色結果（×１００）

圖2 內膜組織Ｅ ｃａｄ免疫組織化學染色結果（×１００）

2.4 子宮內膜增生性病變患者SIX1與E-cad mRNA水平相關性

Pearson法分析結果顯示，單純性增生患者、復雜性增生伴非典型增生患者SIX1與E-cad mRNA水平均呈負相關(r=-0.664、-0.572，P<0.05)。見圖3、圖4(1309頁)。

圖3 單純性增生患者ＳＩＸ１與Ｅ ｃａｄｍＲＮＡ水平相關性

圖4 復雜性增生伴非典型增生患者ＳＩＸ１與Ｅ ｃａｄｍＲＮＡ水平相關性

2.5 子宮內膜增生性病變患者SIX1與E-cad蛋白表達相關性

Spearman法分析結果顯示，單純性增生患者、復雜性增生伴非典型增生患者SIX1與E-cad蛋白表達均呈負相關(r=-0.354、-0.424，P<0.05)。見表4。

表4 不同增生性患者內膜組織SIX1與E-cad蛋白表達相關性(例)

3 討論

子宮內膜增生有一定的癌變傾向，因此被列為癌前病變[6]。子宮內膜增生主要分為單純性增生、復雜性增生、非典型增生，其中單純性增生一般單獨存在[7]。若組織結構為復雜性增生，細胞學上具有非典型改變，則為復雜性增生伴非典型增生[8]。探究子宮內膜增生相關因子，可能對腫瘤的形成和發展有一定的抑制作用。

研究表明，SIX1是一類能調控細胞發生上皮間質轉化的因子，可誘發細胞惡性增殖、分化并出現侵襲性，進而在腫瘤的發生發展中起關鍵作用[9-10]。E-cad不僅調控細胞間黏附，還能直接參與細胞間的信號轉導，在許多腫瘤中均表達下調，且一般伴隨腫瘤細胞極性消失、浸潤能力增強及淋巴結轉移率增高[11]。研究表明，E-cad表達下調可啟動上皮間質轉化，進而造成腫瘤侵襲、轉移，是一種上皮標志物[12]。而子宮內膜增生作為一種癌前病變，其發生發展可能與上皮間質轉化有密切聯系。本研究結果顯示，內膜癌正常子宮內膜組織、單純性增生患者病變內膜組織、復雜性增生伴非典型增生患者病變內膜組織中SIX1 mRNA水平及蛋白表達陽性率依次升高、E-cad mRNA水平及蛋白表達陽性率依次降低，與寧昭芳等[13]、宓淑芳等[14]及Rubesa-Mihaljevic等[15]研究中SIX1、E-cad在子宮內膜癌中的表達趨勢一致。提示SIX1高表達、E-cad低表達可能在子宮內膜增生性病變中發揮重要作用。羅方等[16]研究表明，SIX1對E-cad表達有調控作用且以此影響甲狀腺細胞侵襲轉移。本研究結果中，單純性增生患者、復雜性增生伴非典型增生患者SIX1與E-cad mRNA水平及蛋白表達均呈負相關。提示SIX1與E-cad在功能上可能存在一定的相關性，推測本研究中單純性增生患者疾病發展初期，SIX1表達水平升高，而SIX1作為上皮間質轉化的轉錄調控因子調控其下游靶基因的表達，造成E-cad表達水平下降，進而誘導上皮間質轉化發生，促進疾病進展為復雜性增生伴非典型增生，且有可能進一步影響腫瘤的發生發展。

綜上所述，SIX1、E-cad在單純性增生患者、復雜性增生伴非典型增生患者病變內膜組織中表達水平分別明顯高于、低于內膜癌正常子宮內膜組織，且在復雜性增生伴非典型增生患者中變化更為明顯。本研究中單純性增生患者、復雜性增生伴非典型增生患者SIX1與E-cad存在負相關，二者可能通過負向調控促進子宮內膜增生性病變的發生發展。SIX1、E-cad有望成為一組潛在的子宮內膜增生性病變標志物。但本研究結果可能因樣本量較小存在偏倚，今后將結合動物實驗及細胞分子實驗進一步深入分析。