冷凍精液室溫暴露時間對前向運動精子冷凍復蘇率的影響

鄧順美 馬春杰 龐 韜 王奇玲 劉曉華 唐雨倩 李倩儀 朱勝輝 李月華 張欣宗

廣東省計劃生育科學技術研究所 國家衛生健康委員會男性生殖與遺傳重點實驗室(廣州，510600)

人類精子冷凍保存是人類精子庫工作的重要組成部分。由于場地空間成本限制，大多數冷凍精子標本在液氮罐中處于集中保存狀態。在發放精液過程中，不可避免的會有一些非待發精液標本連同待發精液標本一起暴露于空氣中，導致幾秒至幾分鐘的短暫凍融。目前有關人精子冷凍保存發放過程中連帶暴露導致短暫凍融對復蘇后前向運動精子(PR)復蘇率的影響鮮見報道。本文以世界衛生組織(WHO)推薦使用的甘油-卵黃-檸檬酸鹽(GEYC)冷凍保護劑為人精子冷凍保護劑[1]，檢測對比連帶暴露時間長短對PR精子冷凍復蘇率的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

40份精液標本來自10例于廣東省人類精子庫捐精志愿者。捐精者職業以學生為主，年齡22～45歲。精液篩查標準及捐精要求符合衛生部2003 年頒布的《人類精子庫基本標準和技術規范》[2]的要求。

1.2 分組

將精液標本按照每次室溫(26℃)暴露時間分為1min組、2min組、4min組、對照組(未暴露于室溫)。

1.3 精液準入標準

精液液化時間≤60min，精液量≥2ml，精子濃度≥60×106/ml，PR精子百分率≥60%[2]。

1.4 研究方法

1.4.1標本收集與精液分析研究對象均禁欲3～5d，手淫法收集精液于無菌容器中，37℃恒溫水浴箱中溫育完全液化，計算機輔助精子分析方法進行精液常規分析,包括精子濃度、PR精子百分率(%)等。

1.4.2精液冷凍及復蘇每份精液與冷凍保護劑按體積比例2:1混勻并均分為4份，37℃恒溫水浴箱平衡后分別檢測精子濃度、PR精子百分率(%)，并將4份混有冷凍保護液的精液標本置于液氮上方1cm處熏蒸10 min，然后置于液氮中保存。將裝有實驗組精液標本的標本盒中填充冷凍管(裝有蒸餾水)模擬正常工作時冷凍精液的冷凍環境。凍存2周后，將1min組，2min組，4min組精液標本從液氮中取出，在室溫中分別放置 1 min，2 min，4 min后，之后按照上述方法將實驗組的精液標本重新放回液氮中保存，重復實驗20次，每次實驗間隔控制在(24±2)h。第20次重復實驗2周之后將冷凍精液從液氮中取出室溫放置1 min后，置于 37℃水浴 6 min，檢測精子濃度、PR精子百分率(%)等參數。PR精子冷凍復蘇率=復蘇后PR精子百分率(%)/復蘇前PR精子百分率(%)×100%。

1.4.3試劑和儀器GEYC冷凍保護劑按照文獻[1]方法進行制備和存儲，pH 7.0，細菌培養結果為陰性，無精子毒性。配制GEYC冷凍保護劑所需的葡萄糖、檸檬酸三鈉二水、甘氨酸、甘油均購自Sigma公司(Sigma，America)。計算機輔助精子分析(CASA)系統為SCA 5.2(MicropticInc，Spain)。

1.5 統計學分析

2 結果

按照不同暴露時間重復20次后各組精液冷凍前后PR精子百分率及PR精子冷凍復蘇率數據見表1。各組差異有統計學意義(F=35.947，P<0.05)。其中對照組PR精子冷凍復蘇率顯著高于2min組(P<0.05)、4min組(P<0.05)，與1min組比較PR精子冷凍復蘇率差異無統計學意義(P>0.05)；1min組PR精子冷凍復蘇率顯著高于2min組和4min組(P<0.05)；2min組PR精子冷凍復蘇率顯著高于4min組(P<0.05)。見表1。

表1 不同室溫暴露時長組PR精子冷凍復蘇率比較

3 討論

人類精子對冷凍損傷有一定的耐受能力，而且其耐受能力與凍前精液的質量有一定關系，精子濃度越高，活力越好，對冷凍損傷的耐受能力越強[3]。研究表明，反復凍融對精子活力影響顯著[4]。冷凍保存還能誘導精子DNA損傷，盡管卵子對精子DNA損傷有一定的修復作用，但其修復能力是有限的。因此，精子DNA損傷可能導致基因組突變并導致胚胎改變[3]。為了保證復蘇后的精子質量，必須盡量減少這種冷凍復蘇的循環過程，因為每經歷一次冷凍復蘇循環，精子DNA損傷率明顯增加，精子活動力及存活率明顯下降[5]。

目前國內精子庫普遍采用液氮罐的儲存方式對精液標本進行冷凍保存[6]。液氮罐獨特的層式結構，為精子庫日常工作帶來了很大的方便，同時也為精子儲存造成很多潛在分險。例如在儲存操作時必須將不同人的不同批號的標本統一分裝到統一盒層中，再將不同盒層的標本放入統一提層中，統一冷凍，而取精時，無可避免的要整提提出，再逐層取出盒層，再從盒層中挑出標本使用。這個過程導致了非待發精液標本連帶暴露于空氣之中，這個時間可以持續幾秒或者幾分鐘，形成冷凍復蘇循環。本研究表明，多次暴露室溫下的冷凍標本單次暴露在室溫中的時間越長，冷凍精液的PR精子冷凍復蘇率越低。主要原因可能是在冷凍過程中不同溫度階段中精子會對內環境做出不同的應激。在0～-80℃降溫期間精子內部會形成冰晶，繼而對精子細胞造成損害[7]。除此之外，精子質膜適度的流動性有助于冷凍保護劑進入精子細胞內，而進入細胞內的滲透性保護劑會引起細胞內外滲透壓的相應改變，繼而造成精子細胞脫水，細胞內產生活性氧，使得細胞抗氧化能力降低，最終破壞細胞膜骨架結構[8]。從宏觀的角度講，冷凍精液在空氣中暴露等于冷凍精液標本需要經歷一次由低溫到高溫,再從高溫到低溫的變化過程。精子每一次短暫凍融過程都會或多或少地造成精子DNA損傷，最終影響冷凍精液的復蘇率[9]，而減少冷凍精液在室溫下的暴露時間可能是減少精子凍融損傷的重要方法。

本研究提示，精子庫在發放提取冷凍精液時，應盡量控制非發放冷凍精液室溫暴露時間，暴露時間控制在1min內所受影響較小。

綜上所述，人類冷凍精液室溫反復短暫暴露1min內對PR精子冷凍復蘇率影響甚微，但反復短暫暴露≥2min會顯著影響冷凍精液復蘇質量，損傷精子活力，且暴露時間越長，解凍后PR精子越少，PR精子復蘇率越低。