TNF-α、IL-6、IL-17在胎膜早破母兒感染相關不良妊娠結局中的表達及臨床價值

趙 倩，何 霞，凌 婭，可饒陽，李賽男，黃 蓉，祁文瑾

（昆明醫科大學第一附屬醫院產科，云南 昆明 650032）

胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）是指在臨產前胎膜發生自然破裂導致羊膜腔與外界相通，羊水持續滲漏。在PROM疾病進展過程中感染和炎癥反應與胎膜破裂互為因果，一半以上的PROM患者中存在羊膜內炎癥[1-2]。臨床工作中PROM合并絨毛膜羊膜炎（chorioamnionitis，CS）早期癥狀及常用實驗室指標變化不明顯，一般是在出現產婦發熱和母胎心動過速等臨床體征時才引起關注，易延誤診斷及最佳治療時期。妊娠期多種生物途徑導致子宮NK細胞活化和T細胞特異性亞群的發育，表現為妊娠期獨特的免疫改變：調節性T細胞（Treg）數量增高，Th17數量減少，Th1細胞因子分泌減少，Th2細胞因子分泌增多。PROM發生時Th1/Th2、Th17/Treg細胞平衡打破，相關譜系的細胞因子表達改變[3-4]，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）、白介素（interleukin，IL）-6、IL-17分別為Th1、Th2、Th17細胞的代表性細胞因子。本研究通過檢測母血、臍血中TNF-α、IL-6、IL-17細胞因子在正常妊娠、PROM、PROM合并CS、PROM新生兒圍產期感染孕婦中的水平變化，探討以上細胞因子在PROM母兒感染相關并發癥中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

選取2019年1月至2020年11月于昆明醫科大學第一附屬醫院產科分娩的51例PROM孕婦為觀察組，同期20例正常分娩孕婦為對照組。將觀察組分為PROM無CS組（n=33）和PROM合并CS組（n=18）。觀察組中10例PROM患者新生兒娩出后轉至昆明醫科大學第一附屬醫院NICU并確診為新生兒感染者（新生兒敗血癥4例、新生兒肺炎3例、新生兒真菌感染1例、新生兒腸炎2例）歸為A2組（n=10），其余PROM患者未發生新生兒圍產期感染者歸為A1組（n=41）。PROM及臨床CS的診斷標準參照第九版《婦產科學》[5]，PROM診斷：臨產前出現陰道流液或外陰濕潤，窺陰器檢查見羊水自宮頸口流出或后穹窿液池形成；陰道液測pH≥6.5；陰道液涂片見羊齒狀結晶，出現上述任何一項可確診PROM。臨床CS診斷：（1）孕婦體溫≥38.0 ℃；（2）陰道分泌物異味，羊水惡臭；（3）胎兒心率基線≥160次/分或母親心率≥100 次/分；（4）孕婦外周血白細胞計數≥15×109/L；（5）子宮呈激惹狀態，宮體有壓痛。孕婦體溫升高結合以上其他任何1項陽性體征可診斷為臨床CS。產婦分娩后胎盤組織以HE染色法驗證組織學CS[6]：絨毛膜、羊膜、臍帶任一處組織中出現每高倍鏡視野中有中性粒細胞浸潤≥5個。新生兒圍產期感染診斷標準參照第五版《實用新生兒學》（P510、P531、P582、P622）[7]。排除標準：本研究獲得醫院倫理委員會倫理批準，受試對象對此研究知情同意。2組孕婦均不伴任何孕前基礎疾病及其他妊娠并發癥，年齡在 20～35 歲，單胎妊娠，入院未臨產，產檢資料完整。利用Pass軟件計算機模擬統計效率確定樣本含量。

1.2 方法

1.2.1 標本的制備2組孕婦均在入院時（胎膜破裂12 h內）抽取肘靜脈血3 mL、胎兒娩出后采集臍靜脈血3 mL，將采集的血液標本分別裝于普通無菌干燥試管中，4 ℃條件下待其自然凝固，于3 000 r/min離心20 min后留取血清于-80 ℃冰箱保存，集中測定母血及臍血血清TNF-α、IL-6、IL-17。研究對象胎盤組織以10%甲醛固定送檢病理科。

1.2.2 主要試劑及檢測方法人TNF-α、IL-6、IL-17定量ELISA試劑盒檢測母血、臍血TNF-α、IL-6、IL-17表達水平（欣博盛科技生物有限公司）。胎盤組織石蠟包埋、HE染色后由高年資醫生專人負責閱片檢查組織學絨毛膜羊膜炎。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0統計軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以（）表示，符合非正態分布的計量資料采用M（P25，P75）表示；組間差異比較：計量資料滿足正態分布的連續型變量2組間比較采用t檢驗，2組間比較采用方差分析；非正態分布2組間比較采用非參數Mann-Whitney檢驗，2組間比較采用非參數檢驗的Kruskal-Wallis H檢驗；計數資料組間比較采用卡方檢驗；母血臍血各因子之間表達的相關性采用Spearman相關性分析；采用MedCalc軟件對單項指標直接繪制受試者工作特征（receiver 0perating characteristic，ROC）曲線，聯合檢測時先以Logistics回歸計算出相關聯合指標的回歸方程及聯合預測概率，再將聯合預測概率繪制ROC曲線計算聯合指標的診斷價值。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的一般情況

2組產婦年齡、孕次、孕前BMI值、孕期增重、入院體溫、新生兒出生Apgar評分、新生兒臍動脈pH值差異均無統計學意義（P＞ 0.05），見表1。

表1 研究對象臨床資料比較（）Tab.1 Comparation of clinical information between study objects（）

表1 研究對象臨床資料比較（）Tab.1 Comparation of clinical information between study objects（）

2.2 母血、臍血TNF-α、IL-6、IL-17在對照組、PROM無CS組與PROM合并CS組間表達水平比較

PROM合并CS組母血、臍血血清TNF-α、IL-6表達水平均高于PROM無CS組和對照組（P＜ 0.05）；PROM無CS組母血TNF-α、臍血IL-6的表達水平高于對照組（P＜ 0.05）；2組間母血、臍血IL-17無統計學差異（P＞ 0.05），見表2。

表2 對照組、PROM無CS組、PROM合并CS組母血、臍血各因子表達水平比較Tab.2 Comparation of various cytokine expression levels in maternal serum and umbilical cord serum between the control group，PROM without CS group and PROM with CS group

2.3 母血、臍血TNF-α、IL-6、IL-17的在對照組、A1組和A2組間表達水平比較

PROM組中未發生新生兒圍產期感染者為A1組，PROM發生新生兒圍產期感染者為A2組，A2組母血、臍血血清TNF-α、IL-6和IL-17表達水平均高于A1組和對照組（P＜ 0.05）；A1組母血TNF-α、臍血IL-6的表達水平高于對照組（P＜ 0.05）；見表3。

表3 對照組、A1、A2組母血、臍血各因子表達水平比較Tab.3 Comparation of various cytokine expression levels in maternal serum and umbilical cord serum between the control group，A1 group and A1 group

2.4 TNF-α、IL-6及IL-17的Spearman等級相關性分析

母血、臍血血清中TNF-α、IL-6和IL-17的表達水平均呈顯著正相關，見表4。

表4 各細胞因子在母血、臍血中的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of each cytokine in maternal serum with it in umbilical cord serum

2.5 各因子表達水平的ROC曲線分析

2.5.1 母血、臍血TNF-α、IL-6診斷PROM合并CS的ROC曲線分析比較各因子單項及聯合檢測診斷PROM合并CS的AUC可見：單項檢測時，母血TNF-α的AUC最大（0.763），母血TNF-α的AUC高于臍 血TNF-α（0.614）（P＜0.05）；聯合母血或臍血中TNF-α+IL-6兩項指標診斷PROM合并CS的AUC與母血、臍血中單項指標檢測相比無統計學差異（P＞ 0.05）；聯合母血+臍血TNF-α+IL-6 4項指標診斷PROM合并CS的AUC（0.820）顯著高于臍血TNF-α單項指標的AUC值（0.614）（P＜ 0.05），此外聯合母血+臍血TNF-α+IL-6四項指標診斷PROM合并CS的AUC與其他單獨或聯合檢測指標差異無統計學意義（P＞ 0.05），見表5,圖1。

圖1 母血、臍血TNF-α、IL-6診斷PROM合并CS的ROC曲線Fig.1 ROC curve of TNF-α and IL-6 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with CS

表5 母血、臍血TNF-α、IL-6診斷PROM合并CS的ROC曲線Tab.5 ROC curve of TNF-α and IL-6 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with CS

2.5.2 母血、臍血TNF-α、IL-6和IL-17預測PROM發生新生兒圍產期感染的ROC曲線分析比較各因子單項及聯合檢測預測PROM發生新生兒圍產期感染的AUC可見：單項檢測時，母血中IL-6的AUC最大（0.800），臍血中IL-17的AUC最大（0.829），臍血IL-17的AUC高于母血IL-17（0.735）（P＜ 0.05）；聯合母血、臍血中AUC較大兩項單項指標（母血TNF-α+IL-6、臍血IL-6+IL-17），母血、臍血各三項指（TNF-α+IL-6+IL-17）以及母血+臍血TNF-α+IL-6+IL-17 6項指標診斷PROM發生新生兒圍產期感染的AUC與母血、臍血中單項指標單獨檢測相比無統計學差異（P＞ 0.05）；但聯合臍血IL-6+IL-17 2項指標以及聯合臍血TNF-α+IL-6+IL-17 3項指標診斷PROM發生新生兒圍產期感染的AUC較大（0.863、0.866），診斷效果較好，見表6,圖2。

圖2 母血、臍血TNF-α、IL-6和IL-17診斷PROM新生兒圍產期感染的ROC曲線Fig.2 ROC curve of TNF-α，IL-6 and IL-17 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with neonatal infection during perinatal

表6 母血、臍血TNF-α、IL-6和IL-17診斷PROM發生新生兒圍產期感染的ROC曲線Tab.6 ROC curve of TNF-α，IL-6 and IL-17 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with CS

3 討論

TNF-α屬于Th-1類細胞因子，是一種多向性的促炎細胞因子，胎盤處可由活化的CD4+T淋巴細胞、單核-巨噬細胞，NK 細胞及滋養細胞產生。PROM相關的凋亡途徑可以通過TNF-α受體/fas或P53/Bax介導的途徑發生[8-9]人類胎膜組織的體外研究證明[10-11]：TNF-α也許是能使基質金屬蛋白（matrix metalloproteinases，MMPs）激活的最強介質，而MMPs可通過調節胎膜組織中細胞外基質蛋白代謝的方式促進細胞外基質膠原的降解，從而導致胎膜的破裂。

IL-6屬于Th-2類細胞因子，也可由Th0細胞、妊娠滋養細胞釋放，是gp130細胞因子家族中的一種多功能細胞因子，參與調節急性期反應、參與先天免疫轉變為獲得性免疫的過渡調節。羊水中IL-6的濃度被證明是羊膜內炎癥的可靠生物標志物，足月絨毛膜性羊膜炎婦女羊水中的IL-6濃度與流式細胞術獲得的總白細胞，嗜中性粒細胞或單核細胞/巨噬細胞的數量正相關[12]；同樣，在未足月PROM患者中IL-6濃度也與羊水中的中性粒細胞或單核細胞/巨噬細胞數量顯著正相關[13]。

Th17和Treg 細胞是兩種在免疫反應中起重要作用的 CD4+T淋巴細胞亞型，可橋接適應性免疫反應和先天性免疫反應，其中Th17細胞能分泌IL-17參與炎癥反應、細胞內和細胞外病原微生物感染免疫應答以及自身免疫性疾病等過程。體外研究[14]發現IL-17可通過激活活性氧/核因子kB（ROS/NF-κB）信號途徑的方式誘導MMP-2/MMP-9的表達引發胎膜破裂。

本研究結果顯示PROM合并CS組母血和臍血血清TNF-α、IL-6水平均顯著高于PROM無CS組及對照組，PROM新生兒圍產期感染者母血、臍血血清TNF-α、IL-6、IL-17 3者水平也均高于PROM無新生兒圍產期感染組和對照組，PROM無母兒感染相關不良妊娠并發癥者母血TNF-α、臍血IL-6水平均顯著高于對照組。研究表明，當PROM合并感染時，細菌產物可促進MMPs的激活從而使膠原蛋白降解，細菌激活的天然免疫反應可使包括TNF-α、IL-6在內的促炎細胞因子、趨化因子等激活[15]，血清中單獨升高的IL-17發揮的促炎效果不明顯，但IL-17與其他促炎細胞因子如TNF-α，IL-1β，IL-22，干擾素-γ和粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子同時產生可引發血清IL-6和IL-8水平升高，促進大量活化中性粒細胞的募集到炎癥部位，從而放大中性粒細胞的促炎反應[16]。

本研究母血、臍血TNF-α、IL-6、IL-17分別呈顯著正相關，提示臨床工作中，在分娩前若考慮到臍血標本采集的局限性僅檢測母血TNFα、IL-6、IL-17可有效體現出臍血中的相關因子的水平，反應胎兒的炎癥水平。而胎兒娩出后抽取臍靜脈血檢測以上指標也可先于病檢一步輔助診斷CS和預測未來的新生兒圍產期感染。

ROC曲線分析提示，在預測PROM母兒感染相關不良妊娠結局時母血TNF-α的預測價值優于臍血，臍血IL-17的預測價值優于母血；猜測TNF-α可能參與了PROM母體的感染及炎癥反應，當感染及炎癥進一步影響到胎兒并導致將來發生的新生兒圍產期感染時即促發了胎兒IL-17的產生，IL-17又進一步促進TNF-α、IL-6的產生增多。這與Rito Daniel等[17]的研究相似：暴露于組織學絨毛膜羊膜炎的早產兒的Th17型免疫反應增強。本研究提示IL-17有望成為預測PROM新生兒圍產期感染的新指標。同時發現，多項指標聯合檢測的臨床價值較好，在臨床工作中運用時可能具有較好的真實性和實用性。

TNF-α、IL-6可能參與了PROM母體感染的發生發展，對預測PROM合并CS具備一定的臨床意義，而IL-17可能參與了胎兒宮內感染過程，當PROM患者TNF-α、IL-6、IL-173項指標同時升高時，須警惕嚴重的胎兒宮內感染，臨床工作可盡快終止妊娠、加快產程、加強抗感染治療、積極做好新生兒復蘇準備以及兒科醫生陪同分娩及早做好新生兒轉科治療準備。