森林腦炎滅活疫苗（地鼠腎細胞）細胞工廠培養工藝的建立

張朔，趙建，鄒墅，張穎，趙東山，劉曉杰，劉玥，翟東穎，孫宏亮

1.長春生物制品研究所有限責任公司，吉林長春130012；2.吉林省藥品檢驗所，吉林長春130033

森林腦炎是由森林腦炎病毒引起的一種以侵襲中樞神經系統為主的急性病毒性傳染?。?］，該病目前尚無特異的治療方法，病死率3% ～30%［2-3］。接種疫苗是控制該病流行的最經濟有效的措施［4］。傳統的轉瓶培養工藝制備森林腦炎滅活疫苗存在難以克服的缺陷，主要包括地鼠用量相對較大，不符合關于實驗動物使用的減少、替代及循環使用原則（即3R 原則）；轉瓶使用數量多，具有人工勞動強度大，自動化程度低，效率相對較低，占用空間大，可控制性差，污染風險較高等缺點［5］。而細胞工廠用于大規模的細胞培養，可大量減少地鼠用量，具有空間培養面積大因而占地較小等優點，可達到在有限空間內提高產能、減少人工操作工作量、降低污染風險的目的，同時細胞工廠表面經過特殊處理，可確保細胞黏附和生長的最佳條件［6-7］。

本研究采用細胞工廠培養原代地鼠腎細胞收獲病毒液，經超濾濃縮、滅活、純化后制備了森林腦炎滅活疫苗，建立連續培養多次收獲工藝，以提高疫苗產量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級金黃地鼠，雌性，體重13 ~16 g，日齡12 ~ 14 d，由長春生物制品研究所有限責任公司動物室提供，動物合格證號：201600014430。

1.2 病毒 工作種子森林腦炎病毒森“張”株，第10代，由長春生物制品研究所有限責任公司疫苗三室保存并提供。

1.3 主要試劑及儀器 MEM 培養基（干粉）購自美國Hycolone 公司；199 培養基（干粉）購自美國GIBCO公司；牛血清白蛋白ELISA 檢測試劑盒購自無錫博生醫用生物技術開發有限公司；乳酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；葡萄糖檢測試劑盒購自上海榮盛生物藥業有限公司；新生牛血清購自太原潤生生物材料有限公司；細胞工廠購自美國Corning公司，型號 10 ／ 40 層；Sepharose 4FF 凝膠過濾介質購自美國GE Healthcare 公司；截留相對分子質量300 kD 的超濾膜包購自美國Millipore 公司。

1.4 溶液配制 消化液：將0.5%胰蛋白酶用MEM按照終濃度為0.125%進行稀釋，經7.5% NaHCO3溶液調 pH 至 7.8 ～ 8.2，同時按終濃度 100 IU ／ mL補加硫酸卡那霉素。細胞生長液：在含0.2%乳白蛋白水解物、1%谷氨酰胺的MEM 液中，按終濃度6%加入新生牛血清，并用7.5% NaHCO3溶液調pH 至6.8 ～ 7.2，按終濃度 100 IU ／ mL 補加硫酸卡那霉素。病毒維持液：含1% ~ 2%新生牛血清的199 培養液，用 NaHCO3溶液調 pH 至 7.4 ～ 7.8。

1.5 地鼠用量及接種病毒時間確定 分別取120（3對腎 ／ 層）、140（3.5 對腎 ／ 層）、160（4 對腎 ／ 層）、180（4.5 對腎 ／ 層）及 200 只（5 對腎 ／ 層）地鼠，無菌取腎，于2 ～8 ℃消化18 ～20 h；各組分別接種4個10 層細胞工廠，生長液200 mL ／層，（37 ± 1）℃靜置培養；分別于接種后24、48、68 及72 h 觀察細胞生長狀態，并按下式計算細胞覆蓋率，確定最適地鼠數量及接種病毒時間［8］。每個10 層細胞工廠為1 批。

1.6 病毒收獲時間及次數確定

1.6.1 細胞工廠實驗組（工廠01 ~ 05） 取160 只地鼠為 1 個解剖組，共 5 組，無菌取腎，于 2 ～ 8 ℃消化18 ～20 h；各組均接種1 個40 層細胞工廠，（37 ± 1）℃靜置培養68 ～72 h；待細胞長成致密單層后，按 0.5 MOI 感染森林腦炎病毒，（33 ± 1）℃靜置培養96 h；進行第1 次收獲，收獲后補加維持液，（33 ± 1）℃靜置培養 48 h；進行第 2 次收獲，如此反復進行10 次收獲，至細胞明顯脫落后停止收獲［9-10］。取樣檢測上清液病毒毒力、葡萄糖含量、乳酸含量。病毒毒力檢測按照《中國藥典》三部（2015 版）各論森林腦炎滅活疫苗2.2.3.2 中方法進行；葡萄糖、乳酸含量檢測按試劑盒說明書進行。

1.6.2 10 L 轉瓶對照組（轉瓶01） 取100 只地鼠，無菌取腎，于 2 ～ 8 ℃消化 18 ～ 20 h；接種 5 個 10 L轉瓶，加入細胞生長液 2 L ／ 瓶，（37 ± 0.5）℃培養68 ～72 h；待細胞長成致密單層后，按0.5 MOI 感染森林腦炎病毒，加入病毒維持液 2 L ／ 瓶，（33 ±1）℃培養96 h；進行第1 次收獲，補加病毒維持液2 L ／ 瓶，（33 ± 1）℃培養 48 h［9-10］，進行第 2 次收獲，共收獲4 次，至細胞明顯脫落后停止收獲。取樣，檢測上清液病毒毒力、葡萄糖含量、乳酸含量，方法同1.6.1 項。

1.7 編碼主要保護性抗原核酸的遺傳穩定性檢測 將細胞工廠實驗組第10 次收獲的病毒液作為毒種重新按照0.5 MOI 感染已經長成致密單層的原代地鼠腎細胞，（33 ± 1）℃恒溫室培養96 h 后收獲上清液，即第11 代，如此反復傳至第20 代。對第11~20代收獲后的病毒液抽提RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，以其為模板，利用3 對引物（見表1，由庫美生物科技有限公司合成）。PCR 擴增E 蛋白片段。反應條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min，94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，共 30 個循環；72 ℃ 1 min；4 ℃保存。將擴增后的主要保護性抗原E 蛋白送庫美生物科技有限公司進行測序，分析各代次編碼主要保護性抗原的核酸變異情況。

表1 PCR 擴增用引物Tab.1 Primers for PCR

1.8 原液制備及檢定 分別將3 批40 層細胞工廠（批號：工廠 01 ~ 03）和1 批 10 L 轉瓶（批號：轉瓶01）收獲的病毒液用相同方法制備疫苗原液［9，11］：合并檢定合格的同一細胞批生產的單次病毒收獲液，經連續流離心去細胞碎片（轉速：700 ～1 000×g，流速：1 500 ～ 2 500 mL ／ min），上清液加入終溶度為 500 μg ／ mL 的甲醛 2 ~ 8 ℃滅活 21 d。用截留相對分子質量300 kD 膜包超濾濃縮40 ～60 倍后，采用柱色譜法進行純化，色譜介質為Sepharose 4FF凝膠柱，每次上樣量為柱床體積的5% ～7%，洗脫液為 0.01 mol ／ L PBS，線性流速為 20 ～ 30 cm ／ h，檢測波長為280 nm。收集第1 峰的洗脫液即為純化后的病毒液，經除菌過濾后，即為疫苗原液。按照《中國藥典》三部（2015 版）進行抗原含量、蛋白質含量、地鼠腎細胞蛋白質殘留量、牛血清白蛋白殘余量檢測?？乖坎坏陀? ∶232，蛋白質含量不高于80 μg ／ mL，地鼠腎細胞蛋白質殘留量不高于12 μg ／ mL，牛血清蛋白殘留量不高于 50 ng ／ mL。

2 結 果

2.1 最適地鼠用量及接種病毒時間 結果表明，接種相同對地鼠腎時，4 批細胞工廠之間細胞生長狀態一致，培養時間越長，細胞生長越致密。在相同培養時間時，接種地鼠腎對數與細胞生長狀況不呈線性相關。培養24 和48 h 時，細胞均不能長成致密單層，至72 h 左右時，每個消化批使用140 ~ 200 對地鼠腎（3.5 ～ 5 對腎 ／ 層）時，細胞均可長成致密單層。見圖1。綜合考慮細胞生長情況及實驗動物利用率后，確定每個消化批使用140 ~ 180 對地鼠腎（3.5 ～ 4.5 對腎 ／ 層），培養時間為 68 ～ 72 h。

圖1 細胞工廠不同接種數量細胞生長狀態Fig.1 Growth of cells at various inoculation amounts in cell factory

2.2 病毒收獲時間及次數 細胞工廠實驗組收獲10 次后，細胞出現脫落，停止收獲，第10 次毒力低于《中國藥典》三部（2015 版）標準（即病毒滴度不低于 7.0 lgLD50／ mL），但前 5 次收獲的病毒液葡萄糖及乳酸含量變化較穩定；10 L 轉瓶對照組收獲4 次后，細胞出現明顯脫落，停止收獲。見圖2 和圖3。

圖2 不同培養方式制備的森林腦炎病毒收獲液的病毒滴度Fig.2 Titers of harvested TBE virus cultured by different methods

圖3 不同培養方式制備的森林腦炎病毒收獲液液中葡萄糖（A）及乳酸（B）含量Fig.3 Glucose（A）and lactic acid（B）contents in harvested TBE virus cultured by different methods

測序結果表明，除第11、12 及13 次收獲液的1 260位出現突變，第15、19 及20 次收獲液的608 位出現突變外，其他各代次收獲液均無突變。其中，編碼主要保護區第1 260 位的突變導致堿基由A 突變為C，但由于密碼子簡并性，這種改變并未使其編碼的氨基酸發生改變，均為編碼Leu。編碼主要保護區第608位的突變導致堿基由A 突變為C，編碼的氨基酸也由終止密碼子突變為Cys，但均未改變蛋白的性質。

結合收獲液病毒毒力變化情況、葡萄糖含量變化情況、乳酸含量變化情況、編碼主要保護性抗原的核酸變異情況，細胞工廠實驗組可進行3 ～5 次病毒收獲。

2.3 原液檢定結果 原液中抗原含量、蛋白質含量、地鼠腎細胞蛋白質殘留量、牛血清白蛋白殘余量均符合《中國藥典》三部（2015 版）規定，見表2。根據前期使用地鼠數量摸索，采用細胞工廠工藝每批地鼠投產量可減少40%，仍能夠確保病毒收獲液及原液生產體積不變。

表2 兩種工藝制備疫苗原液檢定結果Tab.2 Control tests on bulks of vaccine prepared by two processes

3 討 論

本文結合轉瓶工藝使用40 層細胞工廠培養原代地鼠腎細胞和森林腦炎病毒，確定了細胞工廠制備森林腦炎滅活疫苗（地鼠腎細胞）的工藝參數：細胞工廠最適細胞接種量為3 ~ 4 對地鼠腎 ／ 層；感染病毒96 h 后第1 次收獲，之后每48 h 收獲1 次，可連續收獲3 ~ 5 次。

將森林腦炎病毒液加入終溶度為500 μg ／ mL的甲醛2 ~ 8 ℃滅活21 d，通過截留相對分子質量300 kD 的膜包進行超濾濃縮后，經Sepharose 4FF柱層析純化后得到疫苗原液，其抗原含量、牛血清白蛋白殘留量、地鼠腎細胞蛋白殘留量均符合《中國藥典》三部（2015 版）要求［11］。

楊睿［12］在《賈第蟲GeRF1 識別終止密碼子性質分析》一文中指出，Paramecium、Tetrahymena 和Stylonychia 將通用終止密碼子UAA 和UAG 翻譯為谷氨酸酰胺，將UGA 識別為終止密碼。Euplotes 中UAA 和UAG 作為終止密碼子，而通用終止密碼子UGA 翻譯成半胱氨酸。由此推測第608 位由于堿基突變造成終止密碼子突變成了半胱氨酸密碼子，該突變并未改變蛋白的性質，突變前終止密碼子和突變后半胱氨酸密碼子表達的氨基酸均為半胱氨酸。因此，從遺傳穩定性方面，采用細胞工廠培養方式連續收獲10 代病毒液對E 蛋白無影響。對多次收獲的病毒液進行測序，結果顯示，連續多次收獲并未改變森林腦炎病毒包膜蛋白E 的活性，表明森林腦炎病毒傳代后遺傳穩定性良好。

利用細胞工廠培養原代地鼠腎細胞制備森林腦炎滅活疫苗，條件易于控制，能大量節約地鼠用量和勞動成本，有效減少污染幾率，獲得較高的細胞密度并收獲高毒力的病毒液，可替代轉瓶大規模生產森林腦炎滅活疫苗［13-15］。